Anticuerpo monoclonal aislado que se une a un complejo receptor de tipo Toll 4 (TLR4)/MD-2 humano,

inhibiendo el anticuerpo monoclonal al menos el 50% de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacárido (LPS) en una disolución que comprende células HEK293 transfectadas con TLR4/MD-2 humano cuando se añade dicho anticuerpo monoclonal a dicha disolución a una concentración de 10 μg/ml, en comparación con el nivel de producción de IL-8 inducida por LPS en ausencia de dicho anticuerpo monoclonal.

Anticuerpos anti-TLR4/MD-2 neutralizantes y métodos de uso de los mismos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a la generación de anticuerpos monoclonales neutralizantes y, en particular, a anticuerpos monoclonales que reconocen el complejo receptor de tipo Toll 4/receptor de MD-2, a anticuerpos monoclonales que reconocen tanto el complejo receptor de tipo Toll 4/receptor de MD-2 como el receptor de tipo Toll 4 cuando no está complejado con MD-2 y a métodos de uso de los anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos. Esta invención también se refiere a proteínas quiméricas solubles, a métodos de expresión y purificación de proteínas quiméricas solubles y a métodos de uso de proteínas quiméricas solubles como agentes terapéuticos, en ensayos de selección y en la producción de anticuerpos.

Antecedentes de la Invención

Los receptores Toll, descubiertos por primera vez en Drosophila, son proteínas transmembrana de tipo I que tienen repeticiones ricas en leucina (LRR) en la parte extracelular de la proteína, y uno o dos dominios ricos en cisteína. Los homólogos en mamíferos de los receptores Toll de Drosophila se conocen como "receptores de tipo Toll" (TLR) . Los TLR desempeñan un papel en la inmunidad innata reconociendo partículas microbianas y activando células inmunitarias contra la fuente de estas partículas microbianas.

Actualmente, se han identificado diez tipos de receptores de tipo Toll en seres humanos, TLR 1-10. Estos TLR se caracterizan por la homología de sus dominios intracelulares con respecto a los del receptor de IL-1, y por la presencia de repeticiones ricas en leucina extracelulares. Los diferentes tipos de TLR se activan por diferentes tipos de partículas microbianas. Por ejemplo, TLR4 se activa principalmente por lipopolisacárido (LPS) , mientras de TLR2 se activa por ácido lipoteitoico (LTA) , lipoarabinomanano (LAM) ; lipoproteína (BLP) y peptidoglicanos (PGN) . También se han identificado homólogos del receptor Toll, tales como RP105.

Se ha identificado y caracterizado la proteína de diferenciación mieloide 2 (MD-2) , una proteína auxiliar de TLR4. Se ha hallado que esta proteína interacciona directamente con TLR4, y MD-2 tiene la capacidad de permitir modificaciones postraduccionales de TLR4, así como facilitar su transporte a la superficie celular. TLR4 y MD-2 forman un complejo en la superficie celular.

El lipopolisacárido (LPS) , un componente de bacterias gram-negativas, es una partícula microbiana que puede activar fuertemente el sistema inmunitario innato. LPS suministra señales a células inmunitarias mediante su receptor de múltiples cadenas, que comprende el complejo TLR4/MD-2 como componente de señalización principal.

Por consiguiente, existe una necesidad de métodos y composiciones que modulen la señalización que está mediada por el complejo TLR4/MD-2.

Sumario de la invención

La invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados que reconocen el complejo receptor TLR4/MD-2, inhibiendo el anticuerpo monoclonal al menos el 50% de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacárido (LPS) en una disolución que comprende células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 humano cuando se añade dicho anticuerpo monoclonal a dicha disolución a una concentración de 10 !g/ml, en comparación con el nivel de producción de IL-8 inducida por LPS en ausencia de dicho anticuerpo monoclonal. En algunos casos, los anticuerpos monoclonales de la invención también reconocen TLR4 cuando no está complejado con D-2 (por ejemplo, proteínas TLR4 solubles, TLR4 expresado en la superficie celular) . Los anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo incluyen 18H10, 16G7, 15C1 y 7E3.

Los anticuerpos de la invención pueden contener una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 12, 22 ó 32 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7, 17, 27 ó 37. Preferiblemente, las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DSYIH (SEQ ID NO: 3) ; WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4) , GYNGVYYAMDY (SEQ ID NO: 5) ; DYWIE (SEQ ID NO: 13) ; EILPGSGSTNYNEDFKD (SEQ ID NO:14) ; EERAYYFGY (SEQ ID NO: 15) ; GGYSWH (SEQ ID NO: 23) ; YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24) ; KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25) ; TYNIGVG (SEQ ID NO: 33) ; HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34) ; y MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO: 35) y una cadena ligera con tres CDR que incluye una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SASSSVIYMH (SEQ ID NO: 8) ; RTYNLAS (SEQ ID NO: 9) ; HQWSSFPYT (SEQ ID NO: 10) ; RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 18) ; RVSNRFS (SEQ ID NO: 19) ; LQVTHWPT (SEQ ID NO: 20) ; RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 28) ; YASHAIS (SEQ ID NO: 29) ; QNGHSFPLT (SEQ ID NO: 30) ; RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 38) ; YTSKLHS (SEQ ID NO: 39) ; y QQGNTFPWT (SEQ ID NO: 40) . El anticuerpo se une al complejo TLR4/MD-2, a TLR4 cuando no está complejado con MD-2, o a ambos.

La presente invención también proporciona los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente para su uso en el tratamiento de septicemia, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedad autoinmunitaria, osteoartritis o artritis reumatoide.

El sujeto que va a tratarse es, por ejemplo, un ser humano. El anticuerpo monoclonal se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado con la patología. La cantidad de anticuerpo monoclonal suficiente para tratar o prevenir la patología en el sujeto es, por ejemplo, una cantidad que es suficiente para reducir la producción de IL-8 inducida por LPS. Tal como se usa en el presente documento, el término "reducción" se refiere a una disminución de la producción de IL-8 en presencia de un anticuerpo monoclonal de la invención, siendo la producción, por ejemplo, la producción de IL-8 local (por ejemplo, en un sitio de tejido inflamado) o la producción de IL-8 sistémica. La producción de IL-8 inducida por LPS disminuye cuando el nivel de producción de IL-8 en presencia de un anticuerpo monoclonal de la invención es superior o igual al 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% inferior a un nivel control de producción de IL-8 (es decir, el nivel de producción de IL-8 en ausencia del anticuerpo monoclonal) . El nivel de producción de IL-8 se mide, por ejemplo, usando la sangre completa humana o los ensayos celulares de HEK293 transfectadas con huTLR4/MD2 descritos en el presente documento. Los expertos en la técnica apreciarán que el nivel de producción de IL-8 puede medirse usando una variedad de ensayos, incluyendo, por ejemplo, kits de ELISA disponibles comercialmente.

Los anticuerpos monoclonales de la invención son para su uso en el tratamiento de una patología seleccionada de septicemia, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica (por ejemplo, inflamación crónica asociada con estados alérgicos y asma) , enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, EII y aterosclerosis) y trastornos inducidos por factores de estrés solubles endógenos (por ejemplo, Hsp60, fibronectina, heparán sulfato, hialuronano, gp96, 1-defensina-2 y proteína tensioactiva A) , trastornos inducidos por factores de estrés solubles endógenos que son osteoartritis y artritis reumatoide. También pueden producirse patologías asociadas con estrés mecánico en sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Tales patologías incluyen, por ejemplo, lesión pulmonar inducida por ventilador ("LPIV") , también denominada lesión pulmonar asociada a ventilación ("LPAV") .

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden incluir un anticuerpo de la invención y un portador. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.

También se dan a conocer proteínas del receptor Toll quiméricas solubles (también denominadas en el presente documento proteínas del receptor de tipo Toll) , métodos para expresar proteínas del receptor Toll y métodos para purificar tales proteínas en una forma soluble.

En particular, se dan a conocer polipéptidos quiméricos en los que un polipéptido del receptor de tipo Toll, o un derivado biológicamente activo del mismo, está operativamente... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal aislado que se une a un complejo receptor de tipo Toll 4 (TLR4) /MD-2 humano, inhibiendo el anticuerpo monoclonal al menos el 50% de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacárido (LPS) en una disolución que comprende células HEK293 transfectadas con TLR4/MD-2 humano cuando se añade dicho anticuerpo monoclonal a dicha disolución a una concentración de 10 !g/ml, en comparación con el nivel de producción de IL-8 inducida por LPS en ausencia de dicho anticuerpo monoclonal.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, no uniéndose el anticuerpo a una proteína MD-2 humana cuando dicha proteína MD-2 no está complejada con TLR4 humano.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, uniéndose adicionalmente el anticuerpo a TLR4 humano soluble.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, uniéndose adicionalmente el anticuerpo a TLR4 humano en una superficie celular.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, siendo el anticuerpo un anticuerpo humanizado.

6. Anticuerpo según la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada con (i) una región determinante de complementariedad 1 de VH (CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en DSYIH (SEQ ID NO: 3) , DYWIE (SEQ ID NO: 13) , GGYSWH (SEQ ID NO: 23) y TYNIGVG (SEQ ID NO: 33) ; (ii) una región determinante de complementariedad 2 de VH (CDR2) seleccionada del grupo que consiste en WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4) , EILPGSGSTNYNEDFKD (SEQ ID NO: 14) , YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24) y HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34) ; y (iii) una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) seleccionada del grupo que consiste en GYNGVYYAMDY (SEQ ID NO: 5) , EERAYYFGY (SEQ ID NO: 15) , KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25) y MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO: 35) .

7. Anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 6, comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera con (i) una región CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SASSSVIYMH (SEQ ID NO:8) , RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO:18) , RASQSISDHLH (SEQ ID NO:28) y RASQDITNYLN (SEQ ID NO:38) ; (ii) una región CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en RTYNLAS (SEQ ID NO:9) , RVSNRFS (SEQ ID NO:19) , YASHAIS (SEQ ID NO:29) y YTSKLHS (SEQ ID NO:39) ; y (iii) una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en HQWSSFPYT (SEQ ID NO:10) ; LQVTHVPPT (SEQ ID NO:20) , QNGHSFPLT (SEQ ID NO:30) y QQGNTFPWT (SEQ ID NO:40) .

8. Anticuerpo según la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 12, 22 y 32 y una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 17, 27 y 37.

9. Uso del anticuerpo según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en septicemia, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedades y trastornos autoinmunitarios inducidos por factores de estrés solubles endógenos en un sujeto en el que se desea tal tratamiento, en el que dicho trastorno inducido por factores de estrés solubles endógenos es osteoartritis o artritis reumatoide.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el sujeto es un ser humano.

11. Uso según la reivindicación 9, en el que se usa una cantidad de anticuerpo según la reivindicación 1 que es suficiente para reducir la producción de IL-8 inducida por LPS.

12. Uso según la reivindicación 9, en el que dicha inflamación crónica está asociada con un estado alérgico o asma.

13. Uso según la reivindicación 9, en el que dicha patología es un trastorno inflamatorio del intestino o aterosclerosis.

14. Uso según la reivindicación 9, en el que dicho factor de estrés soluble endógeno es Hsp60, fibronectina, heparán sulfato, hialuronano, gp96, 1-Defensina-2 o proteína tensioactiva A.

15. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 y un portador.

16. Kit que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1.

17. Anticuerpo según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de una patología seleccionada del grupo que consiste en septicemia, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedades y trastornos autoinmunitarios inducidos por factores de estrés solubles endógenos en un sujeto en el que se desea tal tratamiento, en el que dicho trastorno inducido por factor de estrés soluble endógeno es osteoartritis o artritis reumatoide.