Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Variante de un polipéptido original que comprende una región Fc de una IgG1 o IgG3 humana,

cuya variante presenta una afinidad de unión mejor con respecto al C1q humano que el polipéptido original y comprende una sustitución de aminoácidos en la región Fc de IgG en la posición del aminoácido 326, 333 o 334, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fc de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas que comprenden una región Fe JgG1 o JgG3 humana. Más particularmente, la presente invención se refiere a polipéptidos que contienen la región Fe que han alterado la función efectora como consecuencia de una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fe del polipéptido no variante. La presente invención se refiere asimismo a nuevos complejos inmunitarios y a un ensayo para determinar el enlace de un analito, tal como un polipéptido que contiene la región Fe, con un receptor.

Descripción de la técnica relacionada

Los anticuerpos son proteínas que presentan especificidad de enlace con un antígeno especifico. Los anticuerpos naturales son generalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra enlazada con una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de distintos isotipos de ¡nmunoglobulinas. Las cadenas pesadas y ligeras presentan asimismo puentes disulfuro intracatenarios separados a intervalos regulares. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por un cierto número de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que ciertos aminoácidos particulares constituyen una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada.

El término "variable" se refiere a que determinadas partes de los dominios variables difieren considerablemente en la secuencia entre los anticuerpos y son responsables de la especificidad de enlace de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) en los dominios variables de tanto la cadena ligera como la cadena pesada. Las partes más conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración de hoja (3, unidas por tres CDR, que forman bucles que unen y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja (3. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas muy próximas entre sí gracias a las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace con el antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Los dominios constantes no se encuentran implicados directamente en el enlace de un anticuerpo con un antígeno, pero desempeñan diversas funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o ¡nmunoglobulinas se pueden asignar a distintas clases. Existen cinco clases principales de ¡nmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4; lgA1 e lgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las distintas clases de ¡nmunoglobulinas se denominan a, 6, e, y y p, respectivamente. De las diversas clases de ¡nmunoglobulinas humanas, se conoce que únicamente activan el complemento las lgG1, lgG2, lgG3 e IgM humanas.

Una representación esquemática de la estructura de la lgG1 natural se ilustra en la figura 1, en la que se indican las diversas partes de la molécula del anticuerpo natural. Mediante la digestión con papaína de los anticuerpos se obtienen dos fragmentos de enlace con el antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un sitio único de enlace con el antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. Se ha determinado la estructura cristalina de la región Fe de la IgG humana (Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981)). En las moléculas de la IgG humana, la región Fe se genera mediante escisión aminoterminal con papaína hasta Cys 226. La región Fe resulta fundamental para las funciones efectoras de los anticuerpos.

Las funciones efectoras en las que interviene la región Fe del anticuerpo se pueden dividir en dos categorías: (1) funciones efectoras que actúan tras la unión del anticuerpo con un antígeno (dichas funciones implican la participación de la cascada del complemento o de células que presentan el receptor Fe (FcR)); y (2) funciones efectoras que actúan independientemente de la unión con el antígeno (dichas funciones proporcionan persistencia a la circulación y a la capacidad de transferirse a través de barreras celulares por transcitosis). Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology ["Inmunología terapéutica"] 2:77-94 (1995).

Aunque que el enlace de un anticuerpo con el antígeno necesario tiene un efecto neutralizante que puede impedir la unión de un xenoantígeno a su diana endógena (por ejemplo, un receptor o un ligando), la unión por sí sola no puede eliminar el xenoantígeno. Para ser eficiente en la eliminación y/o destrucción de los xenoantígenos, un anticuerpo debe presentar una elevada afinidad con su antígeno y desempeñar unas funciones efectoras eficientes.

Unión con el C1a

El C1q y dos serina proteasas, C1r y C1s, constituyen el complejo C1, el primer componente de la vía de la citotoxicidad que depende del complemento (CDC). El C1q es una molécula hexavalente con un peso molecular de aproximadamente 460.000 y una estructura parecida con un ramo de tulipanes en el que seis "tallos" contiguos se unen a seis regiones de la cabeza globular. Burton and Woof, Advancesin Immunol. 51:1-84 (1992). Para activar la cascada del complemento, es necesario que el C1q se una a por lo menos dos moléculas de entre la lgG1, la lgG2 o la lgG3 (se considera que la lgG4 no activa el complemento), pero únicamente a una molécula de IgM, unida a la diana antigénica. Ward and Ghetle, Therapeutlc Immunology ["Inmunología terapéutica"] 2:77-94 (1995), página 80.

Basándose en los resultados de las modificaciones químicas y los estudios cristalográficos, Burton et al. (Nature, 288:338-344 (1980)) indicaron que el sitio de enlace del subcomponente del complemento C1q con la IgG implica las dos últimas cadenas (3 (carboxltermlnales) del dominio CH2. Posteriormente, Burton propuso {Motee. Immunol., 22(3):161-206 (1985)) que la reglón que comprende los aminoácidos 318-337 podría estar implicada en la fijación del complemento.

Duncan y Winter (Nature 332:738-40 (1988)), utilizando mutagénesis dirigida, describieron que los aminoácidos Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de unión con el C1q. Los datos de Duncan y Winter se obtuvieron analizando la unión de un isotipo lgG2b de ratón con el C1q de conejillo de indias. El papel que desempeñan los aminoácidos Glu318, Lys320 y Lys322 en la unión del C1q se confirmó mediante la capacidad para inhibir la lisis en la que interviene el complemento de un péptido sintético corto que contenía dichos aminoácidos. Unos resultados similares se describen en la patente US n. 5.648.260, publicada el 15 de julio de 1997, y la patente US n. 5.624.821, publicada el 29 de abril de 1997.

Se ha implicado el aminoácido Pro331 en la unión con el C1q analizando la capacidad de las subclases de IgG humanos para realizar la lisis celular en la que Interviene el complemento. La mutación de la Ser331 a Pro331 en la lgG4 proporcionó la capacidad de activar el complemento. (Tao et al., J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24:2542-47 (1994)).

A partir de la comparación de los datos del grupo de Winter y las publicaciones de Tao et al. y Brekke et al., Ward y Ghetle llegaron a la conclusión en su publicación que existen por lo menos dos regiones distintas implicadas en la unión del C1q: una en la cadena (3 del dominio CH2 que presenta los aminoácidos Glu318, Lys320 y Lys322, y la otra en un giro que se encuentra en la proximidad de la misma cadena (3, y que contiene un aminoácido clave en la posición 331.

Otras publicaciones indican que los aminoácidos Lys235... [Seguir leyendo]

1. Variante de un polipéptido original que comprende una región Fe de una lgG1 o lgG3 humana, cuya variante presenta una afinidad de unión mejor con respecto al C1q humano que el polipéptido original y comprende una sustitución de aminoácidos en la región Fe de IgG en la posición del aminoácido 326, 333 o 334, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fe de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

2. Variante según la reivindicación 1, en la que la afinidad de unión de la variante con respecto al C1q humano es aproximadamente el doble o más que la afinidad de unión del polipéptido original con respecto al Clq humano.

3. Variante según la reivindicación 1, en la que la afinidad de unión de la variante con respecto al C1q humano es aproximadamente cinco veces o más que la afinidad de unión del polipéptido original con respecto al C1q humano.

4. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido original interviene la destrucción celular dependiente del complemento.

5. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido original comprende una región Fe de la lgG1.

6. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el aminoácido de la posición del aminoácido 326 se sustituye portriptófano.

7. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la variante presenta una mayor afinidad de unión con respecto al C1q humano que el polipéptido original y comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones del aminoácido 327 de la región Fe de la IgG humana, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fe de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), en la que la región Fe de la IgG humana es una región Fe de la lgG1 o la lgG3 humana.

8. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la variante presenta una mayor afinidad de unión con respecto al C1q humano que el polipéptido original y comprende sustituciones de aminoácidos en dos o más posiciones de aminoácidos 326, 327, 333 y 334 de la región Fe de la IgG humana, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fe de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al, en la que la región Fe de la IgG humana es una región Fe de la lgG1 o la lgG3 humana.

9. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el polipéptido original comprende un anticuerpo.

10. Composición que comprende la variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

11. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la variante comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones de los aminoácidos 326, 327, 333 o 334 de la región Fe de la IgG humana, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fe de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), en la que la región Fe de la IgG humana es una región Fe de la lgG1 o la lgG3 humana.

12. Variante según la reivindicación 11, que comprende sustituciones de aminoácidos en tres o más posiciones de los aminoácidos 326, 327, 333 o 334.

13. Variante según la reivindicación 12, que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de los aminoácidos 326, 327, 333 y 334.

14. Procedimiento para modificar un polipéptido que comprende una región Fe de una IgG humana que comprende la sustitución de un aminoácido en las posiciones de los aminoácidos 326, 327, 333 o 334 de la región Fe de la IgG humana, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fe de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), en la que la región Fe de la IgG humana es una región Fe de la lgG1 o la lgG3 humana.

15. Ácido nucleico aislado que codifica la variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 a 13.

16. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 15.

17. Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 16.

18. Procedimiento para producir una variante polipeptídica que comprende cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 17, de tal modo que se expresa el ácido nucleico.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además la recuperación de la variante a partir del cultivo de la célula hospedadora.

20. Variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 a 13 para utilizar como medicamento.