Procedimiento continuo de hidrólisis enzimática.

Procedimiento para la hidrólisis enzimática regioselectiva de un sustrato que comprende hacer pasar una disolución tamponada a través de una enzima inmovilizada en un procedimiento continuo,

en el que el sustrato es**Fórmula**

la enzima es lipasa de Candida Antarctica Novozym 435;

la disolución tamponada tiene un pH de 5,5 a 7,5; y

la lipasa de Candida Antarctica hidroliza de manera regioselectiva el éster en la posición 5' del sustrato.

Procedimiento continuo de hidrólisis enzimática Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la hidrólisis enzimática regioselectiva de los grupos alcohol protegidos, por ejemplo, como ásteres o ásteres de aminoácidos o grupos fosfato.

El documento WO05/121162 describe determinados compuestos de D-ribofuranosilo que se preparan mediante hidrólisis selectiva en el grupo en 5 del resto de ribosa del grupo alcohol protegido. Sin embargo, el procedimiento de hidrólisis enzimática tal como se describe en el documento WO05/121162 tiene defectos inherentes al procedimiento heterogéneo tales como por ejemplo, un tiempo de reacción largo, una selectividad limitada en la hidrólisis, un requerimiento de un recipiente grande para cada lote, varias etapas de filtración y sin un reciclado fácil de la enzima.

La presente invención proporciona ahora un procedimiento mejorado para la hidrólisis enzimática regioselectiva que supera muchos de los defectos del procedimiento de hidrólisis regioselectiva usado anteriormente. Según la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que, usando un procedimiento continuo para la hidrólisis enzimática regioselectiva de sustratos que tienen más de un grupo hidrolizable, puede lograrse una mayor selectividad de la hidrólisis y menos impurezas con un producto de hidrólisis no deseado. Además, un procedimiento continuo de este tipo constituye una solución económica y a largo plazo con respecto al procedimiento discontinuo largo y costoso usado anteriormente que tiene una baja producción. El procedimiento de la invención puede reducir drásticamente el ciclo de tiempo y minimizar el impacto del bajo rendimiento volumétrico global en comparación con, por ejemplo, el procedimiento descrito en el documento WO05/121162. Esto es particularmente relevante para las ampliaciones a escala del procedimiento cuando aumentan los volúmenes del procedimiento.

Por consiguiente, en su aspecto más amplio, la presente invención proporciona un procedimiento para la hidrólisis enzimática regioselectiva de un sustrato que comprende más de un grupo hidrolizable en el que dicha hidrólisis enzimática se realiza en un modo continuo.

En el procedimiento continuo según la presente invención, se hace pasar normalmente una disolución tamponada de aducto a través de una enzima inmovilizada. El término "continuo" según la presente invención se refiere a un procedimiento que se hace pasar de manera continua (sin interrupciones) a través de la columna. Tras un tiempo de residencia adecuado, el aducto se hidroliza completamente ya que puede monitorizarse in situ, por ejemplo, mediante monitorización del pH de la disolución que comprende el producto recogido después de la columna y extraído posteriormente. Es necesario ajustar los parámetros críticos del procedimiento continuo individualmente dependiendo, por ejemplo, del sustrato, la enzima etc. y pueden determinarse empíricamente caso por caso. Tales parámetros incluyen, por ejemplo, el tiempo de residencia, el relleno de la columna, el pH óptimo, la temperatura, la concentración de aducto, la elección del disolvente orgánico. El tiempo de residencia, por ejemplo, se ajusta de tal manera que el aducto se hidroliza de manera óptima, es decir con alta selectividad y conversión rápida y puede ser normalmente de desde 0,1 min hasta 300 min. El tiempo de residencia, por ejemplo, depende de la actividad enzimática, la temperatura, el pH, el sistema de disolventes y se ajusta de tal manera que permita el procesamiento continuo y la hidrólisis óptima tal como se definió anteriormente. El pH y la temperatura se escogen habitualmente según las condiciones que necesite la enzima para la reacción de hidrólisis. Por ejemplo, el pH puede estar en el intervalo de entre, por ejemplo, 5 y 8 o, por ejemplo, de 5,5 a 7,5. La temperatura puede estar en el intervalo de, por ejemplo, 15°C a 70°C.

Puede usarse cualquier tampón adecuado para la reacción enzimática, tal como, por ejemplo, un tampón fosfato, un tampón amonio, un tampón carbonato, un tampón acetato.

Además, puede usarse un componente orgánico adecuado para permitir la solubilización completa del aducto y el producto. Los componentes orgánicos típicos incluyen, por ejemplo, acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona, metanol, etanol, iso-propanol, n-butanol, 3-metil-l-butanol, 2-metoxietanol, 2-etoxietanol, ferc-butil metil éter tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo, diclorometano, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, líquidos iónicos, gases comprimidos tales como dióxido de carbono, agua, o similares, y mezclas de los mismos. También pueden imaginarse otros alcoholes, éteres, cetonas.

Adicionalmente, pueden usarse aditivos, por ejemplo, para acrecentar la velocidad de la reacción. Los aditivos típicos incluyen, por ejemplo, PEG (a del 1% al 10%), NaCI, Na2SC>4, FeCI3. La concentración adecuada de tales aditivos puede determinarse empíricamente y puede estar normalmente en un intervalo de concentración de 0,05 M a 1 M. Convenientemente, los aditivos pueden añadirse a la disolución de aducto.

La enzima se inmoviliza sobre un soporte físico,, por ejemplo, un soporte sólido. Un soporte físico para la enzima inmovilizada adecuado para la presente invención incluye, por ejemplo, una columna, un tanque con agitación continua, un reactor de lecho relleno, un reactor de membrana, una membrana. Puede usarse cualquier enzima adecuada para la hidrólisis según la presente invención, tal como por ejemplo, esterasas, hidrolasas, lipasas.

Los sustratos adecuados para los procedimientos de la presente invención contienen al menos dos grupos que son hidrolizables, es decir por ejemplo, dos acetatos, benzoatos. Ejemplos típicos de tales grupos son grupos de alcohol protegidos como ásteres, ásteres de aminoácidos, fosfatos. En una realización, los sustratos son piranósidos o furanósidos.

Según un aspecto de la presente invención, el sustrato es un compuesto tal como representa generalmente (sin estereoquímica) mediante las fórmulas (1) a (21)

en las que R es independientemente H, alquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, -NRR", -SR"\ halógeno; R y R" son independientemente alquilo, -SR", -SO", -SO2R"; R" es independientemente H, alquilo, arilo; R1 es independientemente H, -C(0)R3,un grupo de aminoácido L, D o racémico -C(0)CH2NHR4, -C(0)CH(alquil Ci-6)NHR4, fosfato; R3 es un alquilo Cms; R4 es H, -C(0)CH(alquil Ci-6)NH2 o -C(0)CH(CH2-aril)NH2; B es una base nitrogenada; X, Y e Y son independientemente -CH2-, -CHR-, -CRR" u -O, NR", S en la que R y R" son independientemente alquilo y R" es H o alquilo o CO(Z), siendo Z O-alquilo o NH-alquilo o N-(alquilo)2 y R2 es H, -C(0)CH(alquil Ci-6)NH2 o -C(0)CH(CH2-aril)NH2.

El término "alquilo", tal como se usa en el presente documento, incluye radicales hidrocarbonados monovalentes saturados que tienen restos lineales, ramificados o cíclicos (incluyendo restos bicíclicos y espirocíclicos condensados y con puente) o una combinación de los restos anteriores. Los ejemplos de grupos alquilo preferidos incluyen alquilos Cms o C1-12. Un grupo arilo puede no estar sustituido o estar sustituido en cualquier posición. Normalmente, porta 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes. En otra realización preferida, el alquilo es alquilo inferior, tal como por ejemplo, C1-6 más preferiblemente C1-4. Se prefieren particularmente metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec- o ferc-butilo, n-pentilo o pentilo ramificado. Un grupo alquilo puede no estar sustituido o estar sustituido en cualquier posición. Normalmente, porta 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes.

El término "alquenilo", tal como se usa en el presente documento, incluye restos alquilo que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono en el que el alquilo es tal como se definió anteriormente e incluyendo los isómeros E y Z de dicho resto alquileno. El término "alquinilo", tal como se usa en el presente documento, incluye restos alquilo que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono en el que el alquilo es tal como se definió anteriormente.

El término "arilo", tal como se usa en el presente documento, incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un hidrógeno y es normalmente un grupo arilo C6-10. Un grupo arilo puede no estar sustituido o estar sustituido en cualquier posición. Normalmente, porta 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes. Los ejemplos típicos incluyen fenilo o naftilo.

El término "fosfato", tal como se usa en el presente documento, incluye uno o varios grupos fosfato, por ejemplo, -(HO(PO)OH)m -(HO(PO(OH))OH), m es 0, 1 ó 2 y n es 0, 1,2, 3, 4, 5.

1. Procedimiento para la hidrólisis enzimática regioselectiva de un sustrato que comprende hacer pasar una disolución tamponada a través de una enzima inmovilizada en un procedimiento continuo, en el que el sustrato es

2.

3.

4.

la enzima es lipasa de Candida Antárctica Novozym 435; la disolución tamponada tiene un pH de 5,5 a 7,5; y

la lipasa de Candida Antárctica hidroliza de manera regioselectiva el éster en la posición 5 del sustrato.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el sustrato está en una disolución tamponada y se hace pasar la disolución tamponada a través de la enzima inmovilizada a una velocidad de 0,1 ml/min a 50 ml/min o de 0,5 ml/min a 10 ml/min.

Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la disolución tamponada comprende un tampón fosfato, un tampón amonio, un tampón carbonato o un tampón acetato.

Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la disolución tamponada comprende un tampón fosfato.