Un proceso para la producción de nucleósidos, que comprende la reacción de una pentosa-1-fosfato con una base de purina o pirimidina,

caracterizado porque dicha reacción está catalizada por células productoras de uridina fosforilasa (UPasa) y/o purina nucleósido fosforilasa (PNPasa), que se han inmovilizado adsorbiendo dichas células en una resina de intercambio aniónico débil, en donde dichas células son células de Escherichia coli y dicha resina es Duolite A568®

Un proceso para la inmovilización de células en una resina.

Campo de aplicación

La presente invención en general se refiere a un proceso para la inmovilización de células y al uso de una resina para la inmovilización de células.

Técnica anterior

Desde hace varias décadas¹ la inmovilización de células es un técnica bien conocida, usada con el fin de mejorar procesos de fermentación y biosíntesis. Las técnicas más normalmente usadas para inmovilizar células son aquellas que implican el establecimiento de enlaces covalentes entre las células y un soporte inorgánico activado, como por ejemplo sílice silanizado² o tratado con glutaraldehído e isocianato³, o un entrecruzamiento entre las células mediante reactivos bi- o polifuncionales, tales como por ejemplo, glutaraldehído⁴ y diisocianato de tolueno o la captura en matrices poliméricas, como por ejemplo, agar, alginatos, carragenanos, celulosa y sus derivados, colágeno, gelatina y poliacrilamida.

Una técnica que se usa menos que las anteriores está representada por la adsorción en soportes tales como tierra de diatomeas, vidrio, cerámica y materiales plásticos, producida por interacciones electrostáticas (fuerzas de Van der Waals) entre el soporte y las células.

En 1960-61 se describió un ejemplo^5,6 de adsorción de células en una resina de intercambio iónico, y precisamente la adsorción de células de Escherichia coli en una resina de intercambio aniónico fuerte (Dowex 1), pero después de eso en la bibliografía solo se citan ejemplos de inmovilización de células realizadas mediante captura, en general sobre carragenano, alginatos y poliacrilamidas.

Esto es probablemente debido a la escasa estabilidad de las inmovilizaciones obtenidas hasta ahora mediante las técnicas de adsorción y particularmente de las inmovilizaciones en resinas.

Sería deseable en su lugar hacer disponible un proceso para inmovilizar células de forma permanente en resinas mediante adsorción, porque de tal manera las células no se someten a choque mecánico ni a degradación química, se mantienen a sí mismas vitales y mantienen a un nivel máximo su propia capacidad de mantener las enzimas que producen en condiciones fisiológicas óptimas y para catalizar consecuentemente reacciones que son útiles para diferentes vías biosintéticas o de fermentación.

Compendio de la invención

El problema subyacente a la presente invención era el de proporcionar un proceso para inmovilizar células de forma permanente mediante adsorción a resinas, de tal manera que se puedan usar particularmente para realizar reacciones catalizadas por las enzimas producidas por las células mismas.

Tal problema se resolvió, según la invención, mediante un proceso para inmovilizar células, que incluye una fase de adsorción de tales células en un resina en donde dichas células son células de Escherichia coli y dicha resina es la resina de intercambio aniónico débil, resina Duolite A568® (Rohm & Haas).

En el proceso de inmovilización de células según la presente invención, se usa preferiblemente una relación entre el peso húmedo de las células (pasta celular) y el peso seco de la resina comprendida entre 0,5:1 y 2:1, ventajosamente alrededor de 1:1. La pasta celular tiene un contenido de agua comprendido entre el 70 y el 80% peso/peso.

La inmovilización se realiza operando en un medio tamponado acuoso a pH 7,4, preferiblemente usando un tampón fosfato con una molaridad que varía entre 0,1 M y 1 M, ventajosamente igual a alrededor de 0,5 M.

El tiempo de contacto entre la resina y las células necesario para obtener la inmovilización de las últimas es mayor de o igual a 24 horas y preferiblemente mayor de o igual a 72 horas.

Mediante el proceso según la presente invención también es posible inmovilizar al mismo tiempo en la resina al menos dos tipos de células diferentes, que son capaces de producir diferentes enzimas.

En particular, es posible coinmovilizar células de Escherichia coli que producen uridina fosforilasa (UPasa) y células de Escherichia coli que producen purina nucleósido fosforilasa (PNPasa).

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de nucleósidos, que comprende la reacción reversible de una pentosa-1-fosfato con una base de purina o pirimidina, en presencia de células que producen UPasa y/o PNPasa, inmovilizadas por medio del proceso descrito anteriormente, en donde dichas células son células de la especie de Escherichia coli.

El término "nucleósidos" se refiere tanto a nucleósidos naturales como modificados, así como los términos "base de purina" y "base de pirimidina" se refieren tanto a bases naturales como a bases modificadas.

Según una forma de realización adicional, dichas células se coinmovilizan en la resina.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso para la transglicosilación de nucleósidos, que comprende la reacción entre un nucleósido de pirimidina y una base de purina o entre un nucleósido de purina y una base de pirimidina o entre un nucleósido de pirimidina y una base de pirimidina que es diferente de la presente en dicho nucleósido de pirimidina o por último entre un nucleósido de purina y una base de purina que es diferente de la presente en dicho nucleósido de purina, en donde tal reacción se produce en presencia de células que producen UPasa y de células que producen PNPasa o en presencia de células que producen UPasa y PNPasa, en donde dichas células que producen UPasa y dichas células que producen PNPasa son células de Escherichia coli y en donde dichas células se inmovilizan mediante el proceso de inmovilización descrito anteriormente.

El uso de células de Escherichia coli de la cepa DH5alfa transformadas por los vectores plásmidos que tienen las secuencias descritas en las Seq. Id. No. 1 y 2 es particularmente preferido.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso de transglicosilación entre 2'-fluoroadenina y arabinofuranosil uracilo para dar fludarabina, en donde tal reacción se produce en presencia de células productoras de UPasa y de células productoras de PNPasa o en presencia de células que producen UPasa y PNPasa, en donde dichas células productoras de UPasa y dichas células productoras de PNPasa son células de Escherichia coli y en donde dichas células se inmovilizan mediante el proceso de inmovilización descrito anteriormente.

La utilización de células de Escherichia coli de la cepa DH5alfa transformadas por los vectores plásmidos que tienen las secuencias descritas en las Seq. Id. No. 1 y 2 es particularmente preferido. Adecuadamente, las células de Escherichia coli transformadas con los vectores plásmidos de la Seq. Id. No. 1 y con los vectores plásmidos de la Seq. Id. No. 2 se coinmovilizan en la resina.

Descripción detallada de la invención

El proceso para inmovilizar células según la presente invención se alcanzó durante estudios y experimentos cuyo fin era mejorar un sistema de biocatalizadores utilizable para la producción, incluso a escala industrial, de nucleósidos y análogos modificados, particularmente en referencia a fludarabina.

Para este fin, se decidió usar reacciones de bioconversión, usando enzimas procariotas, que son preferibles porque tienen una especificidad de sustrato más amplia, son fácilmente obtenibles en grandes cantidades de fuentes celulares y se conocen bien respecto a sus vías metabólicas.

Los sistemas enzimáticos que se pueden usar para la biosíntesis de nucleósidos naturales y/o modificados son principalmente dos: desoxirribosil transferasas (DRTasas) y nucleósido fosforilasas (NP)^7,8.

Las desoxirribosil transferasas tienen la desventaja de ser muy específicas para 2-desoxirribosa y por esta razón sólo se pueden usar para desoxinucleótidos en posición 2'.

Las nucleósido fosforilasas son enzimas, que están presentes en la mayoría de las bacterias, en levaduras y también en eucariotas superiores y se dividen en dos clases basadas en su estructura cuaternaria, su plegamiento y la clase de sustrato sobre el que actúan.

En particular, las enzimas uridina fosforilasa (E.C. 2.4.2.3) y purina nucleósido fosforilasa (E.C. 2.4.2.1) están particularmente indicadas para realizar reacciones de...

1. Un proceso para la producción de nucleósidos, que comprende la reacción de una pentosa-1-fosfato con una base de purina o pirimidina, caracterizado porque dicha reacción está catalizada por células productoras de uridina fosforilasa (UPasa) y/o purina nucleósido fosforilasa (PNPasa), que se han inmovilizado adsorbiendo dichas células en una resina de intercambio aniónico débil, en donde dichas células son células de Escherichia coli y dicha resina es Duolite A568®.

2. Un proceso para la transglicosilación de nucleósidos, que comprende una reacción entre

en donde dicha reacción está catalizada por células productoras de UPasa y células productoras de PNPasa o por células productoras de UPasa y PNPasa, caracterizado porque dichas células se inmovilizan adsorbiendo dichas células en una resina de intercambio aniónico débil, en donde dichas células son células de Escherichia coli productoras de UPasa y células de Escherichia coli productoras de PNPasa y dicha resina es Duolite A568®.

3. Un proceso según la reivindicación 2, en donde dicha reacción se produce entre 2'-fluoroadenina y arabinofuranosil-uracilo y produce fludarabina.

4. Un proceso según la reivindicación 1 ó 2, en donde dichas células de Escherichia coli son células de la cepa DH5alfa transformadas con los vectores plásmidos que tienen las secuencias descritas en Seq. Id. No. 1 y 2.

5. Un proceso según la reivindicación 4, en donde dichas células se coinmovilizan en la resina.

6. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación entre el peso húmedo de dichas células y el peso seco de dicha resina está comprendida entre 0,5:1 y 2:1 y es preferiblemente alrededor de 1:1.

7. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se inmovilizan dos tipos diferentes de células al mismo tiempo, en donde dichos dos tipos de células son células de Escherichia coli productoras de UPasa y células de Escherichia coli productoras de PNPasa.