METODO PARA PRODUCIR NUCLEOSIDO DIFOSFATO USANDO POLIFOSFATO: AMP FOSFOTRANSFERASA.
Un método para producir nucleósido difosfato en el que el nucleósido difosfato se produce enzimáticamente a partir de nucleósido monofosfato seleccionado entre IMP,
CMP, DCMP, UMP y TMP usando una polifosfato:AMP fosfotransferasa (PAP) recombinante que está libre de actividad degradadora de AMP, dicha PAP:
(i) teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o teniendo una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o
(ii) estando codificada por un gen de PAP que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1;
estando codificada por un gen de PAP que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2;
estando codificada por un gen que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2; o
estando codificada por un gen que hibrida con la secuencia de la SEC ID Nº 2 en condiciones rigurosas;
comprendiendo dicho método el uso del nucleósido monofosfato a una concentración de 10 a 100 mM y de polifosfato a una concentración de 10 a 200 mM
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP03/06646.
Solicitante: YAMASA CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 10-1, ARAOICHO 2-CHOME,CHOSHI-SHI, CHIBA 288-0056.
Inventor/es: SHIBA,TOSHIKAZU, NOGUCHI,TOSHITADA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/12 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12N9/12B4
- C12P19/30 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Nucleótidos.
- C12P19/32 C12P 19/00 […] › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleótidos púricos, dinucleótido de la nicotinamida-ademina.
- C12P19/40 C12P 19/00 […] › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleósidos púricos.
Clasificación PCT:
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
- C12N9/12 C12N 9/00 […] › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12P19/40 C12P 19/00 […] › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleósidos púricos.
Clasificación antigua:
- C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
- C12N9/12 C12N 9/00 […] › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12P19/40 C12P 19/00 […] › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleósidos púricos.
Fragmento de la descripción:
Método para producir nucleósido difosfato usando polifosfato: AMP fosfotransferasa.
Campo técnico
Esta invención se refiere a un método para producir nucleósido difosfato usando una polifosfato:AMP fosfotransferasa.
Técnica antecedente
Los recientes avances en ingeniería genética han permitido la producción a gran escala de diversas enzimas a bajo coste, y también se ha permitido un proceso económico usando una reacción enzimática para la producción de sustancias fisiológicamente activas valiosas, que se han producido convencionalmente por medio de bioconversión usando una bacteria vivas, fermentación o síntesis química.
Mientras tanto, una reacción enzimática que requiere energía, como en el caso de fosforilación y aminación necesita adenosin 5'-trifosfato (ATP) como su donador de energía o donador de fosfato. En la transformación y fermentación microbiana convencionales, el ATP fue suministrado por el microorganismo empleado, mientras que, en el caso del proceso enzimático, se requieren la adición de ATP al sistema de reacción y el desarrollo de un sistema eficaz de regeneración de ATP.
Sin embargo, el proceso de síntesis económica de ATP aún no se ha establecido y el ATP disponible en el mercado sigue siendo muy caro. Además, el sustrato y la enzima usados en el sistema común de regeneración de ATP, concretamente, la combinación de fosfocreatina y fosfocreatina quinasa, o acetil fosfato y acetato quinasa son muy caros, y su uso ha sido poco práctico y ha estado limitado a nivel del laboratorio.
En contraste con dicho alto precio del ATP, puede producirse adenosin 5'-monofosfato (AMP) a un coste relativamente bajo. El ATP se produce actualmente mediante síntesis química o usando microorganismo o levadura a partir de AMP o adenina. Por consiguiente, ha sido muy esperado el desarrollo de un proceso eficaz de regeneración de ATP que pueda usarse en el sistema de reacción enzimática que usa el ATP, en el que el ATP se produzca enzimáticamente a partir del relativamente económico AMP y el ATP consumido se regenere eficazmente en lugar de añadir el caro ATP.
Al construir un sistema práctico de generación/regeneración de ATP, la selección del donador de fosfato usado también es importante, y el polifosfato, que es económico y estable, se ha considerado el candidato más prometedor como donador de fosfato. Las enzimas que se sabe que están implicadas en el metabolismo del polifosfato que también actúan con adenosin nucleótido incluyen polifosfato quinasa y polifosfato:AMP fosfotransferasa (en lo sucesivo en este documento abreviada como "PAP").
La PAP es una enzima que fosforila AMP para producir ADP usando polifosfato como donador de fosfato (J. Bacteriol., 173, 6484-6488(1991)). Zenhder et al., describió que un sistema de generación/regeneración de ATP en el que AMP y polifosfato son los sustratos funciona, cuando la PAP obtenida de Acinetobacter johnsonii se purifica parcialmente, y la PAP parcialmente purificada se usa junto con adenilato quinasa (Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045-2051(2000)). Kameda et al., describió que, en el sistema de reacción enzimática en el que se consume ATP para generar AMP, un sistema en el que se genera ATP a partir de AMP usando polifosfato como donador de fosfato funciona eficazmente cuando se usa la combinación de la PAP de Myxococcus xanthus y polifosfato quinasa de E. coli.
Sin embargo, PAP está presente en la célula de Acinetobacter johnsonii en una cantidad extremadamente pequeña, y con respecto al uso de la PAP en bruto tal como extracto celular, se ha señalado el problema de que la contaminación de las enzimas que descomponen la sustancia implicada en la reacción (AMP, ADP, ATP, sustrato de reacción y/o producto de reacción) puede provocar la pérdida de eficacia de la reacción. Dicho problema puede obviarse mediante el uso de PAP altamente purificada en lugar de la enzima en bruto. La PAP, sin embargo, es muy inestable, y el procedimiento de purificación de PAP es demasiado complicado para adoptar dicha PAP purificada en un uso práctico.
Al abordar dicho problema, los inventores de la presente invención estimaron que dicho problema puede abordarse produciendo la PAP de Acinetobacter johnsonii en gran cantidad usando una técnica de ADN recombinante. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de la enzima y el gen para dicha enzima no se han descrito en absoluto.
Descripción de la invención
Los inventores de la presente invención han tenido éxito en la producción en masa de la PAP en E. coli construyendo un sistema de cribado adaptado para la clonación de genes mediante actividad de PAP, y la clonación del gen que codifica la PAP usando el sistema de cribado construido de este modo. En el análisis de la PAP recombinante producida de este modo, los inventores también descubrieron que la enzima tiene una actividad específica extremadamente alta, y la combinación de dicha enzima con adenilato quinasa permite la construcción de un sistema eficaz de generación/regeneración de ATP.
De forma inesperada, los inventores también descubrieron que la PAP recombinante tiene la actividad de transferencia de fosfato usando polifosfato como donador de fosfato para generar nucleósido difosfato incluso si el nucleósido monofosfato no era AMP ni GMP, y esto constituye una diferencia respecto a la PAP convencional obtenida a partir de Acinetobacter johnsonii.
Aunque el nucleósido difosfato se ha mostrado generalmente útil como un material de partida para sintetizar enzimáticamente polinucleótido usado en instalaciones médicas o químicas, su síntesis distaba de ser fácil. En el caso de la bioconversión, la fosforilación no puede terminarse en la fase de difosfato, y la fosforilación química fue la única manera utilizable para la producción de nucleósido difosfato. Sin embargo, la fosforilación química se asocia con el problema de que se produce de forma simultánea la reacción secundaria que da como resultado la formación de sub-productos, y el aislamiento y purificación del nucleósido difosfato diana a partir de la solución de reacción ha sido extremadamente complicada. En vista de dicha situación, el desarrollo de un proceso eficaz para sintetizar el nucleósido difosfato mediante fosforilación enzimática del nucleósido monofosfato es altamente esperado, y la PAP se ha considerado un candidato como enzima usada en la síntesis enzimática.
Sin embargo, Zehnder et al., describió que, la PAP de Acinetobacter johnsonii es específica de AMP, y aunque se descubrió alguna transferencia de fosfato para GMP, no se descubrió fosfotransfererencia en absoluto para otros nucleótidos (CMP, UMP, e IMP) (Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045-2051 (2000)), y se ha considerado que, la PAP no puede usarse en la síntesis de nucleósido difosfato mediante fosforilación enzimática del nucleósido monofosfato.
Los inventores de la presente invención realizaron un estudio intensivo en base a los nuevos descubrimientos que se han descrito anteriormente, y completaron la presente invención. La PAP usada de acuerdo con la presente invención tiene las propiedades físicas y químicas que se describen a continuación:
Esta invención usa una PAP que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 en la que se ha producido la deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos, como se especifica mediante la reivindicación.
La PAP puede estar codificada por un gen de PAP que codifica la secuencia...
Reivindicaciones:
1. Un método para producir nucleósido difosfato en el que el nucleósido difosfato se produce enzimáticamente a partir de nucleósido monofosfato seleccionado entre IMP, CMP, DCMP, UMP y TMP usando una polifosfato:AMP fosfotransferasa (PAP) recombinante que está libre de actividad degradadora de AMP, dicha PAP:
comprendiendo dicho método el uso del nucleósido monofosfato a una concentración de 10 a 100 mM y de polifosfato a una concentración de 10 a 200 mM.
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