Método para producir cladribina (2-cloro-2''-desoxiadenosina) que comprende los pasos de:

a) reacción de 2-desoxiuridina con 2-cloroadenina, en presencia de uridina fosforilasa (UPasa) y purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) en un medio de reacción acuoso que opcionalmente contiene hasta el 40% v/v de un solvente dipolar aprótico, para obtener cladribina disuelta en dicho medio de reacción; b) aislamiento de la cladribina mediante precipitación por medio de concentración y alcalinización del medio de reacción hasta pH 11,5-12,5

Método para la producción de cladribina.

Campo de aplicación

La presente invención se refiere a un método para producir cladribina (2-cloro-2'-desoxiadenosina).

Más específicamente, la invención se refiere a un método para producir cladribina por medio de una reacción de transglicosilación.

Técnica anterior

Como se sabe, la cladribina (2-cloro-2'-desoxiadenosina) es una molécula usada como fármaco antineoplásico en el tratamiento de leucemia y otras neoplasias y tiene la siguiente fórmula (I):

Se han descrito varios métodos de síntesis de cladribina; entre éstos se destacan los siguientes.

La solicitud de patente de EE.UU. No. 52080327 (Chen, R.H.K., presentada el 16 de abril de 2002) describe un método de síntesis de cladribina empezando a partir de guanosina en 7 pasos de síntesis química con el uso de numerosos reactivos.

La solicitud de patente de EE.UU. No. 6252061 describe una síntesis que prevé una halogenación directa de 2,6-diaminopurina desoxirribosa en una mezcla de solventes próticos y apróticos, en presencia de un ácido de Lewis y un nitrito orgánico. La síntesis prevé una purificación en columna del producto final.

La solicitud de patente internacional WO 2004/028462 describe una síntesis para la halogenación directa de 2'-desoxiguanosina seguida por una separación cromatográfica para cada intermedio.

La solicitud de patente EP 173 059 describe una síntesis que prevé una condensación de una base de purina y una desoxirribosa adecuadamente protegida.

La solicitud de patente de EE.UU. No. 2002/0052491 describe una síntesis que empieza a partir de cloroadenina y desoxirribosa adecuadamente protegida, con rendimientos mejorados con respecto a EP 173 059 y eliminación del paso de purificación en columna.

La solicitud de patente de EE.UU. No. 2004/0039190 describe una reacción entre cloroadenina adecuadamente protegida y desoxirribosa adecuadamente protegida, con rendimientos mejorados con respecto a US 2002/0052491.

La producción de cladribina por medio de procesos de síntesis química tiene limitaciones significativas, ya que tales procesos con frecuencia consisten en reacciones de múltiples fases, que comprenden reacciones de protección y desprotección que empiezan a partir de compuestos que son caros y/o difíciles de encontrar en el mercado, y algunas veces implica reacciones no estereoespecíficas (es decir, que producen el producto final tanto en la conformación a como ß). Tales procesos son por lo tanto largos y costosos, y los rendimientos raramente son satisfactorios. Por lo tanto, estos tipos de procesos, por su naturaleza, no son aptos para ser empleados a una escala industrial.

Por otra parte, las reacciones enzimáticas, tales como por ejemplo las reacciones de glicosilación y transglicosilación, se prestan mejor para su uso a un nivel industrial y la variedad de enzimas disponibles en la naturaleza permite seleccionar la estereoespecificidad y regioselectividad deseada de la reacción. Tales reacciones normalmente requieren, por lo tanto, un paso final de purificación (por ejemplo, por medio de precipitación o filtración) de la mezcla de productos para aislar, al nivel de pureza deseado, el producto de la enzima, el sustrato sin reaccionar y de posibles coproductos de reacción (por ejemplo, isómeros).

Otra ventaja de las reacciones enzimáticas con respecto a las reacciones de síntesis es el hecho de que las enzimas que se usan, además de estar disponibles en el mercado, también se encuentran fácilmente en grandes cantidades y a bajo coste, en la naturaleza, por ejemplo del cultivo de células bacterianas.

Por lo tanto es posible cultivar las bacterias que producen la enzima de interés y aislar la enzima de las células bacterianas. De forma alternativa, las reacciones enzimáticas se pueden llevar a cabo usando células bacterianas enteras, produciendo la última solución normalmente reacciones menos eficientes (con, por lo tanto, rendimientos menores) que sin embargo son más convenientes y económicas.

Las reacciones enzimáticas se pueden clasificar en reacciones de enzimas libres y reacciones de enzimas inmovilizadas. En el primer caso, las enzimas se añaden a la mezcla de reacción, mientras que en el segundo caso las enzimas (o las células bacterianas) se inmovilizan en soportes adecuados.

La inmovilización de las enzimas o células bacterianas produce la ventaja de no tener que separar las enzimas de la mezcla de productos al final de la reacción y de permitir, por lo tanto, la recuperación de las enzimas o las células bacterianas y reutilizarlas para una reacción posterior. La inmovilización permite además llevar a cabo las reacciones de forma continua o por lotes, obteniéndose por lo tanto mayores rendimientos y alcanzándose mayor idoneidad para su uso en una escala industrial.

Por último, las reacciones enzimáticas se pueden optimizar por medio de manipulación genética de las bacterias que producen la enzima. Tal manipulación normalmente tiene como fin conferir un mayor rendimiento de enzima o actividad enzimática. Sin embargo, se pueden considerar otros factores tales como la supresión de la producción de otras posibles enzimas por el microorganismo, la estereoselectividad o regioselectividad de la enzima de interés, etc.

Se describen reacciones enzimáticas para producir cladribina en numerosos artículos y patentes. Entre ellos se destacan los siguientes.

En Michailopulo, I A et al (1993) Nucleosides & Nucleotides, 12 (3&4) 417-422, se describe la síntesis bioquímica de cladribina empezando de cloroadenina y desoxiguanosina en presencia de células de E. coli.

La solicitud de patente de EE.UU. No. 2006/0094869 describe una reacción entre cloroadenina y desoxirribosa-1-fosfato en presencia de enzima purina nucleósido fosforilasa (PNP) purificada.

Los documentos mencionados anteriormente describen procesos de producción de cladribina que mientras son ventajosos con respecto a los métodos químicos descritos anteriormente, implican sin embargo, varios inconvenientes, incluyendo rendimientos bajos, sustratos (por ejemplo desoxiguanosina y desoxirribosa-1-fosfato) que son difíciles de encontrar y por último pasos del proceso (tal como el aislamiento final en cromatografía en columna) de difícil aplicación industrial.

El último paso de aislamiento y purificación del producto final ha sido en general el más problemático para el proceso de producción entero de la cladribina por medios enzimáticos.

El problema técnico que subyace a la presente invención es por lo tanto el de hacer disponible un método para la producción de cladribina que permita obtener rendimientos de producto que sean iguales o mayores que los de la técnica anterior, empezando a partir de materias primas económicas, fáciles de encontrar, y que al mismo tiempo sea económicamente ventajoso y permita un aislamiento fácil del producto final.

Compendio de la invención

Tal problema se resuelve según la presente invención mediante un método para producir cladribina (2-cloro-2'-desoxiadenosina) que comprende los pasos de:

Las enzimas UPasa y PNPasa pueden estar presentes en el medio de reacción en forma de enzimas libres o enzimas inmovilizadas en soportes adecuados, o se pueden producir in situ por células que las producen, que a su vez pueden estar presentes en el medio de reacción en forma libre o en forma inmovilizada.

Cuando se usan células productoras de la enzima UPasa o células productoras de la enzima PNPasa, o cuando se usan células productoras tanto de la enzima UPasa como de PNPasa, tales células preferiblemente se inmovilizan mediante adsorción sobre una resina de intercambio aniónico débil, en particular sobre una resina de intercambio aniónico débil que tiene grupos funcionales...

1. Método para producir cladribina (2-cloro-2'-desoxiadenosina) que comprende los pasos de:

2. Método según la reivindicación 1, en donde dichas enzimas UPasa y PNPasa se producen in situ por células capaces de producirlas.

3. Método según la reivindicación 2, en donde dichas células productoras de UPasa y PNPasa se inmovilizan en un soporte adecuado.

4. Método según la reivindicación 3, en donde dicho soporte está compuesto de una resina de intercambio aniónico débil, sobre la que se adsorben dichas células.

5. Método según la reivindicación 4, en donde dicha resina tiene grupos funcionales amino y se elige preferiblemente del grupo que comprende las resinas Dowex MWA1 (Dow Chemical), Diaion WA30 (Mitsubishi), Duolite A7®, Amberlite FPA54®, Amberlyst 21 y Duolite A568® (Rohm & Haas).

6. Método según la reivindicación 5, en donde resina es Duolite A568® (Rohm & Haas).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en donde dichas células productoras de UPasa y PNPasa son células de la especie Escherichia coli.

8. Método según la reivindicación 7, en donde dichas células son células de Escherichia coli de la cepa DH5alfa, transformadas por medio de vectores plasmídicos que tienen las secuencias descritas en Secuencia Id. No. 1 y 2.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho solvente dipolar aprótico consiste en dimetilformamida y/o dimetilsulfóxido.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho paso de alcalinización produce un pH final de alrededor de 12.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la 2-desoxiuridina y la 2-cloroadenina se hacen reaccionar en una relación molar que varía de 1:1 a 3:1.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre 2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se lleva a cabo en un medio tamponado a un pH en el intervalo de 6,5-8,5, preferiblemente en el intervalo de 7,3-7,8.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre 2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se realiza a una temperatura en el intervalo de 50-70ºC, preferiblemente alrededor de 60ºC.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre 2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se lleva a cabo añadiendo gradualmente una solución de 2-cloroadenina en una mezcla de agua y un solvente dipolar aprótico al medio de reacción acuoso tamponado a pH 6,5-8,5 y que contiene las enzimas y la 2-desoxiuridina.

15. Método según la reivindicación 14, en donde dicha solución de 2-cloroadenina se prepara resuspendiendo la 2-cloroadenina en un solvente dipolar aprótico y añadiendo una solución concentrada de un hidróxido alcalino hasta que la disolución de 2-cloroadenina es completa.

16. Método según la reivindicación 15, en donde dicho solvente dipolar aprótico es dimetilformamida o dimetilsulfóxido y el hidróxido alcalino es KOH, usado a una concentración en el intervalo del 20-30% peso/volumen.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde, al mismo tiempo que la adición de la solución de 2-cloroadenina, se lleva a cabo la adición de una solución acuosa de un ácido fuerte, a tal velocidad que se mantenga el pH de la mezcla de reacción entre 6,5-8,5, preferiblemente entre 7,3-7,8.

18. Método según la reivindicación 17, en donde dicho ácido fuerte se elige entre ácido clorhídrico y ácido fosfórico.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho paso de concentración sigue a dicho paso de alcalinización.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende los pasos adicionales de recuperación de la cladribina precipitada por medio de filtración y posterior recristalización de la misma.

21. Método según la reivindicación 20, en donde dicha recristalización se lleva a cabo mediante una mezcla hidroalcohólica, preferiblemente etanol:agua 95:10.