Modulación del sistema receptor Trpv:receptor de dominio Vps 10p para el tratamiento del dolor.

Un procedimiento in vitro para detectar un agente que es capaz de inhibir la formación de un:

a. complejo binario del receptor de dominio Vps10p : receptor Trpv, y/o

b. complejo ternario del receptor de dominio Vps10p : TrkA : receptor Trpv, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i. proporcionar un receptor de dominio Vps10p y un receptor Trpv, o

ii. proporcionar un receptor de dominio Vps10p y un receptor Trpv y un receptor TrkA, y

iii. proporcionar una biblioteca de agentes potenciales, y

iv. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor de dominio Vps10p a una segunda entidad receptor Trpv, o

v. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor Trpv a una segunda entidad receptor de dominio Vps10p, o

vi. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor Trpv a una segunda entidad complejo binario (receptor de dominio Vps10p : receptor TrkA), o

vii. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (receptor de dominio Vps10p : receptor TrkA) a una segunda entidad receptor Trpv, o

viii. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor de dominio Vps10p a una segunda entidad complejo binario (TrpV : receptor TrkA), o

ix. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (TrpV : receptor TrkA) a una segunda entidad receptor de dominio Vps10p, o

x. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor TrkA a una segunda entidad complejo binario (TrpV : Receptor del dominio Vps10p), o

xi. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (TrpV : receptor de dominio Vps10p) a una segunda entidad receptor TrkA, y

xii. añadir la biblioteca de agentes potenciales que deben ser ensayados al ensayo seleccionado de iv a xi, y

xiii. determinar la cantidad de dicha primera entidad respecto de dicho segunda entidad, y

xiv.comparar la cantidad determinada en la etapa xiv) con una cantidad medida en ausencia del agente que debe ser ensayado, en el que la diferencia en las dos cantidades identifica un agente que altera la unión de la primera entidad respecto de la segunda entidad.

Modulación del sistema receptor Trpv:receptor de dominio Vps 10p para el tratamiento del dolor

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para detectar un agente que es capaz de inhibir un complejo de señalización de dolor, en el que dicho complejo es un complejo del receptor TrpV : receptor de dominio Vps10p binario, y/o un complejo ternario entre el complejo del receptor TrpV : receptor de dominio Vps10p binario y una tercera entidad, tal como, pero sin limitarse a un receptor TrkA, formando de ese modo el complejo ternario del receptor de dominio Vps10p : receptor Trpv : receptor TrkA .

Antecedentes de la invención El dolor agudo y dolor crónico difieren en su etiología, fisiopatología, diagnóstico y tratamiento. El dolor agudo es autolimitado y cumple una función biológica protectora actuando como una advertencia del daño tisular en curso. Es un síntoma de un proceso de enfermedad experimentado en o alrededor del tejido lesionado o enfermo. El dolor agudo es nociceptivo por naturaleza, y es secundario a agentes químicos, y la estimulación térmica y mecánica de A- delta y los receptores del dolor C - polimodales.

Dolor crónico, por otra parte, no tiene ninguna función biológica de protección. En lugar de ser el síntoma de un proceso de enfermedad, el dolor crónico es en sí un proceso de enfermedad. El dolor crónico es implacable y no auto-limitante y como se dijo anteriormente, puede persistir durante años y hasta décadas después de la lesión inicial. El dolor crónico, no maligno es predominantemente neuropático por naturaleza e implica daños a los sistemas nerviosos central o periférico. Después de una lesión del nervio periférico (por ejemplo aplastamiento, estiramiento, o axotomía) se produce sensibilización que se caracteriza por la actividad espontánea por la neurona, un umbral menor para la activación y un aumento en la respuesta a un estímulo dado.

El dolor neuropático, que es el dolor iniciado o causado por una lesión primaria o disfunción en el sistema nervioso se estima que tiene una prevalencia en EE.UU. del 1, 5%, es decir, en total 4 millones de personas se ven afectadas por las afecciones [1].

Se manifiesta como un estado crónico de hiperexcitabilidad en la parte del sistema nervioso que transmite el dolor. Existen receptores del dolor especiales llamados nociceptores recogidos en la superclase Trp del potencial receptor transitorio. Incluyen los receptores vaniloides sensibles a la temperatura (Trpv) , los canales de sensibilización de ácido y receptores mecano [2].

Muy por el contrario toda lesión o enfermedad en el sistema nervioso da lugar a dolor neuropático. Esta variación se debe a una predisposición genética [3]. Por lo tanto aproximadamente el 8% de las operaciones convencionales en las que se cortan nervios inevitablemente da como resultado condiciones de dolor crónico relacionado con la región de la cicatriz [4].

El dolor se clasifica en dolor nociceptivo, inflamatorio y neuropático [5]. El primero causado por un estímulo nocivo es de corta duración, el dolor inflamatorio es más duradero y es provocado por los mediadores inflamatorios del proceso de enfermedad que disminuyen el umbral de la percepción del dolor. El umbral se normaliza cuando se cura la inflamación. En caso de dolor neuropático, la disminución del umbral inducido por la lesión en la región afectada no vuelve a la normalidad, es por así decirlo irreversible fijado en un umbral más bajo de lo normal. Esto significa que un estímulo que no causa dolor en una persona sana puede dar lugar a la sensación de dolor en la zona afectada en un paciente. Si se siente que un estímulo por debajo de lo que una persona normal puede percibir en absoluto es doloroso, se lo llama alodinia. La hiperalgesia se utiliza para caracterizar el aumento de la intensidad de la sensación de dolor que una persona neuropática experimenta cuando se aplica un estímulo doloroso "normal" [6].

No existe cura causal hoy en día para las afecciones de dolor neuropático. El sistema de salud sólo puede ofrecer insuficiente alivio del dolor [1, 7]. Para los analgésicos clásicos como opioides y fármacos anti-inflamatorios no esteroideos la curva de dosis-respuesta se desplaza a la derecha, lo que significa que se necesita dosis mucho más grande para el alivio del dolor [8, 9]. Los anestésicos de bloqueadores de canales de Na+, tales como carbamazepina, lamotrigina y lidocaína muestran efecto cuando se administran de forma sistemática, pero producen efectos adversos graves [10, 11]. El tratamiento con anticonvulsivos como gabapentina que actúa disminuyendo el influjo de Ca2+ en las neuronas ha demostrado ser eficaz para amortiguar la intensidad de dolor, pero no para neutralizarlo por completo. Los antidepresivos tricíclicos median su efecto a través de un intervalo de sistemas de transmisión por ejemplo, los serotoninérgicos y noradrenérgicos. Son Actúa Los mismos actúan a nivel central y en la periferia. Son eficaces, pero el perfil de efectos adversos no es atractivo [12].

Por lo tanto existe una necesidad urgente de fármacos que modulan/interfieren específicamente con los procesos moleculares que regulan el nivel umbral en el tejido nervioso afectado para evitar el inicio o el desarrollo de los procesos que conducen al nivel de umbral más bajo para el dolor. Otro mecanismo podría ser constantemente suprimir los eventos moleculares que mantienen el umbral en el modo menor.

Analgesia Si mejores medicamentos tienen que ser desarrollados es necesario hacer frente a los objetivos que son centrales para la generación de dolor a través de la iniciación y regulación del nivel umbral de dolor [3].

La sensibilización del nivel umbral de dolor que tiene lugar a través de la inflamación e implica una larga fila de mediadores -la llamada sopa inflamatoria, que entre otros incluyen la serotonina, histamina, prostaglandinas, bradiquinina, sustancia P, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) , factor de crecimiento nervioso (NGF) y diversas citoquinas. En relación a la lesión del nervio la neurotrofina NGF puede ser particularmente importante aunque otros mediadores también pueden participar. NGF es un miembro de la familia de neurotrofinas que comprende NGF, BDNF, NT-3 y NT-4. Las neurotrofinas pueden interactuar con el receptor no selectivo p75NTR, así como su cognato quinasa del receptor de tirosina; NGF se une preferentemente a los receptores de tirosina quinasa A (TrkA) ; BDNF y NT4 a TrkB ; y la neurotrofina 3 (NT-3) a TrkC. Generalmente se ha considerado que estas interacciones son de alta afinidad Sin embargo, en la realidad, la unión de NGF a TrkA, y de BDNF a TrkB, es de baja afinidad, pero puede ser regulada por la dimerización del receptor, modificaciones estructurales o asociación con p75NTR, . El receptor p75 puede unirse a cada neurotrofina, y también actúa como un co-receptor para los receptores Trk, sortilina y otros receptores de dominio Vps10p (cf. Fig. 1) .

Una vez que NGF se une, puede producirse un evento de dos etapas de TrkA: Primero, en la superficie de las neuronas sensoriales, TrkA interactúa físicamente con TrpVl, un miembro de una gran familia de canales catiónicos no selectivos permeables al calcio, que está implicado en el desarrollo de la hiperalgesia térmica inducida por la lesión de tejidos y la inflamación, y en el dolor crónico y neuropático [13]. La unión de NGF a TrkA potencia fuertemente el influjo de calcio por TrpVl y la inducción de dolor. En segundo lugar, la unión de NGF a TrkA y p75NTR también se traduce en el transporte retrógrado del complejo de nuevo al cuerpo celular de las neuronas donde el mismo modula la actividad y la transcripción de las proteínas importantes para la supervivencia y diferenciación neuronal, pero también de las enzimas y canales iónicos implicados en la transmisión nociceptiva [3, 14]. También la microglia puede desempeñar un papel en esta activación [15].

Después de la lesión de un nervio, la cantidad de NGF disminuye en las neuronas sensoriales, pero después de un tiempo vuelve a aumentar debido a la secreción de células de Schwann, macrófagos y probablemente también debido a las propias neuronas. Esto estimula la regeneración del nervio.

Además, se ha demostrado que el proNGF, una forma precursora de NGF, interactúa con un complejo del receptor heterómero que consiste en p75NTR y Sortilina formando así un complejo ternario. A diferencia de las actividades tróficas provocadas por el NGF maduro, proNGF produce apoptosis por la formación de dicho complejo ternario a través de p75NTR y Sortilina, a menos que proNGF sea convertido en su forma madura [24].

Anteriormente [16] relacionó las... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para detectar un agente que es capaz de inhibir la formación de un:

a. complejo binario del receptor de dominio Vps10p : receptor Trpv, y/o

b. complejo ternario del receptor de dominio Vps10p : TrkA : receptor Trpv, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i. proporcionar un receptor de dominio Vps10p y un receptor Trpv, o ii. proporcionar un receptor de dominio Vps10p y un receptor Trpv y un receptor TrkA, y

iii. proporcionar una biblioteca de agentes potenciales, y

iv. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor de dominio Vps10p a una segunda entidad receptor Trpv, o

v. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor Trpv a una segunda entidad receptor de dominio Vps10p, o

vi. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor Trpv a una segunda entidad complejo binario (receptor de dominio Vps10p : receptor TrkA) , o vii. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (receptor de dominio Vps10p : receptor TrkA) a una segunda entidad receptor Trpv, o viii.proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor de dominio Vps10p a una segunda entidad complejo binario (TrpV : receptor TrkA) , o

ix. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (TrpV : receptor TrkA) a una segunda entidad receptor de dominio Vps10p, o

x. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad receptor TrkA a una segunda entidad complejo binario (TrpV : Receptor del dominio Vps10p) , o

xi. proporcionar un ensayo para medir la unión de una primera entidad complejo binario (TrpV : receptor de dominio Vps10p) a una segunda entidad receptor TrkA, y

xii. añadir la biblioteca de agentes potenciales que deben ser ensayados al ensayo seleccionado de iv a xi, y

xiii.determinar la cantidad de dicha primera entidad respecto de dicho segunda entidad, y

xiv.comparar la cantidad determinada en la etapa xiv) con una cantidad medida en ausencia del agente que debe ser ensayado, en el que la diferencia en las dos cantidades identifica un agente que altera la unión de la primera entidad respecto de la segunda entidad.

2. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 1, en el que dicho receptor de dominio Vps10p se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 2, SEC ID NO. 3, SEC ID NO. 4 y SEC ID NO. 5.

3. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 1, en el que dicho receptor Trpv es al menos 60% idéntico, tal como 65% idéntico, tal como 70% idéntico, tal como 75% idéntico, tal como 80% idéntico, tal como 85% idéntico, tal como 90% idéntico, tal como 95% idéntico, tal como 96% idéntico, tal como 97% idéntico, tal como 98% idéntico, tal como 99% idéntico, tal como 100% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO. 6, SEC ID NO. 7, SEC ID NO. 8 y SEC ID NO. 9.

4. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el receptor TrkA es al menos 60% idéntico, tal como 65% idéntico, tal como 70% idéntico, tal como 75% idéntico, tal como 80% idéntico, tal como 85% idéntico, tal como 90% idéntico, tal como 95% idéntico, tal como 96% idéntico, tal como 97% idéntico, tal como 98% idéntico, tal como 99% idéntico, tal como 100% idéntico a SEC ID NO. 10.

5. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el agente es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos recombinantes, fragmentos de anticuerpos incluyendo fragmentos Fab.

6. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está dirigido contra una parte extracelular o una parte intracelular del receptor de dominio Vps10p o el dominio intracelular del receptor de dominio Vps10p.

7. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 6, en el que el receptor de dominio Vps10p es Sortilina

(SEC ID NO.: 1) .

8. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 7, en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de SEC ID NO. 1

o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

9. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 7, en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y S584 a F588 de SEC ID NO. 1 o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

10. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 7 en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de SEC ID NO. 1 o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

11. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 7 en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T451, Y466, I498 y V500 de SEC ID NO. 1 o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

12. El procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en el que el anticuerpo es seleccionado de los anticuerpos que se describen en la tabal 1.

13. El procedimiento de acuerdo a la reivindicación 5-12, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anti-dominio antiextracelular de cabra de un anticuerpo de SorLA humana, dominio anti-citoplásmico de conejo de anticuerpo SorLA humana, repetición anti-complementaria de conejo de anticuerpo de SorLA humana, dominio antiextracelular de conejo de anticuerpo de SorLA humana, dominio anticitoplasmático de conejo de anticuerpo de SorLA humana, dominio anti-Vps10p de conejo de anticuerpo de SorLA humana, secuencia antipeptídica de conejo en el dominio Vps10p de anticuerpo de SorLA humana, anti-C-terminal de conejo de anticuerpo de SorLA humana, cola anticitoplasmática de conejo de anticuerpo de SorLA humana, dominio antiextracelular de ratón de anticuerpo de SorLA humana, dominio antiextracelular de conejo de anticuerpo de Sortilina humana, dominio anticitoplasmático de conejo de anticuerpo de Sortilina humana, anti-propéptido de conejo de anticuerpo de Sortilina humana, dominio anti-Vps10p de conejo de anticuerpo de Sortilina humana, dominio antiextracelular de cabra de Sortilina humana, dominio antiextracelular de ratón de anticuerpo de Sortilina humana, dominio antiextracelular de cabra de anticuerpo de SorCS1 humana, dominio antiextracelular de conejo de anticuerpo de SorCS1 humana, dominio rico en antileucina de conejo de anticuerpo de SorCS1 humana, dominio antiextracelular de ratón de anticuerpo de SorCS1 humana, dominio antiextracelular de oveja de anticuerpo de SorCS2 humana, dominio antiextracelular de cabra de anticuerpo de SorCS2 humana, dominio antiextracelular de conejo de anticuerpo de SorCS2 humana, aminoácidos del extremo terminal C anti-28 de conejo de SorCS2 humana, anti-propéptido de conejo de anticuerpo de SorCS2 humana, dominio antiextracelular de ratón de SorCS2 humana, aminoácidos del extremo terminal C anti-15 de conejo de anticuerpo de SorCS3 humana, dominio anti-N-terminal de conejo de anticuerpo de SorCS3 humana, dominio antiextracelular de conejo de SorCS3 humana, dominio antiextracelular de ratón de SorCS3 humana y dominio antiextracelular de cabra de anticuerpo de SorCS3 humana.

14. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está dirigido contra el receptor Trpv.

15. El procedimiento de de acuerdo a la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está dirigido contra el receptor TrkA.