Heparinasa III y sus usos.

Una heparinasa III modificada, sustancialmente pura, que comprende:

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo histidina seleccionado del grupo consistente en His36, His105, His110, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 e His539 ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina.

Heparinasa III y sus usos CAMPO DE LA INVENCIÓN

La Invención se refiere a formas modificadas de heparinasa III. En particular, la invención se refiere a formas modificadas de heparinasa III con actividad enzimática reducida, que son útiles para una diversidad de propósitos, Incluyendo la secuenclación de glicosaminoglicanos similares a heparina (HLGAGs - siglas en inglés), la separación de HLGAGs a partir de una disolución, la inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la coagulación, etc. La Invención, en otros aspectos, se refiere a formas modificadas de heparinasa III para tratar el cáncer e inhibir el crecimiento de células tumorales y/o metástasis o productos HLGAG producidos por escisión enzimática con formas modificadas de heparinasa III.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Glicosaminoglicanos similares a heparina (HLGAGs) son componentes importantes de la matriz extracelular, que se piensa que regulan una amplia diversidad de actividades celulares, incluyendo la invasión, migración, proliferación y adhesión. Khodapkar, et al. 1998; Woods, et al., 1998). Los HLGAGs logran algunas de estas funciones mediante uniéndose a y regulando las actividades biológicas de diversas moléculas, incluyendo factores de crecimiento, morfógenos, enzimas, proteínas extracelulares. Los HLGAGs son polisacáridos lineales que se caracterizan por una unidad repetitiva disacárido de un ácido uránico [ácido a-L-idurónico (I) o ácido (3-D-glucurónico (G)] enlazado a 1,4 a-B-hexosamina (H). (1) Estos polímeros de 2-1 unidades disacárido pueden modificarse adicionalmente a través de N- y O-sulfatación, epimerización en la posición C5 del resto de ácido uránico, añadiendo una micro- heterogeneidad adicional a estas moléculas de información densas. (1.5).

A pesar de que la estructura y la química de HLGAGs están bastante bien comprendidas, información sobre cómo secuencias de HLGAG específicas modulan diferentes procesos biológicos ha demostrado ser más difícil de obtener. Los autores de la invención han desarrollado recientemente una metodología de secuenciación rápida para polisacáridos utilizando herramientas químicas y enzimáticas para modificar o degradar un polímero de HLGAG desconocido de una manera específica para la secuencia. (Venkataraman, G., et al., Science, 286,537-542 (1999), y Solicitudes de Patente de EE.UU. N° de serie. 9/557.997 y 9/558.137, ambas presentadas el 24 de abril de 2). Una herramienta enzimática Importante en este proceso de secuenciación son las heparinasas, incluyendo heparinasas I, II y III. Las tres heparinasas son enzimas de degradación de HLGAG que se pueden producir por parte de Flavobacterum heparinum. Cada una de los heparinasas tiene su propia secuencia de HLGAG única en la que se escinde, haciendo de estas enzimas valiosas herramientas para obtener una información específica de la secuencia. La heparinasa I escinde principalmente HLGAGs en el enlace HNs,6x-l2s2 que se encuentra principalmente en las reglones similares a heparina (Ernst, S., et al., Crit, Rev. Biochem. Mol. Biol., 3, 387-444 (1995)). Desal, U., et al., Biochemistry 32, 814-8145 (1993)), y Jandik, K., et al., Glycobiology, 4, 289-296 (1994)). La heparinasa III escinde en los enlaces Hnac-I y Hny,6x-G2 que son los principales disacáridos encontrados en el sulfato de heparán (Ernst, et al., (1995), supra, y Linhardt, R., et al., Biochemistry, 29, 2611-2617 (199)). La heparinasa II es capaz de reconocer y escindir ambos conjuntos de enlaces de sustrato (Ernst, etal., (1995), supra). Recientemente, los autores de la invención han identificado varios residuos que son críticos para la actividad de heparinasa I y heparinasa II. Se encontró que la cisteína 135 y la histidina 23, así como las lisinas 198, 199 y 132 de heparinasa I eran críticas para la actividad enzimática de la molécula. Se determinó que la cisteína 348 y las hlstldlnas 238, 451 y 579 eran cruciales para la actividad heparinasa II. (Solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación, N° 9/384.959; Sasisekharan, R., et al., Biochemistry, 34, 14441-14448 (1995); Godavarti, R., et al., Biochemistry, 35, 6846-6852 (1996); Godavarti, R., y Sasisekharan, R., J. Biol. Chem. 273, 248-255 (1998); Shriver, Z., et al, J. Biol. Chem., 273, 2294-22912 (1998); y Shriver, Z., J. Biol. Chem., 273, 116-1167 (1998)).

La heparinasa III es única, ya que es el único miembro de la familia de la heparinasa que reconoce y escinde preferencialmente sulfato de heparán. La heparinasa III tampoco contiene cisteínas en su secuencia de aminoácidos.

La metástasis de tumores implica la propagación de células tumorales principalmente a través de la vasculatura a sitios remotos en el cuerpo. Se piensa que a medida que la matriz extracelular se degrada, las interacciones célula tumoral-matriz extracelular se desensamblan, liberando la célula tumoral para atravesar el lecho capilar. Se han logrado avances extraordinarios para dilucidar los roles de colágeno y proteínas relacionadas, enzimas (colagenasas y otras) que degradan las proteínas de la matriz extracelular para regular la angiogénesis tumoral y/o invasión de células tumorales.

Recientemente también se ha planteado la hipótesis de que enzimas que degradan HLGAG, heparinasas, ayudan en la degradación de la matriz extracelular para regular el crecimiento del tumor, la angiogénesis y la metástasis. Se ha sugerido que la expresión de heparinasas en asociación con el desarrollo de tumores representa una

conmutación de un tumor metastásico a un tumor no metastásico y desempeña un papel en la Iniciación del proceso de metástasis. La hipótesis fue reafirmada por la reciente clonación de un gen humano heparinasa y por la demostración de una malignidad incrementada de las células cancerosas mediante la sobre-expresión del producto del gen de la heparinasa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto, de acuerdo con un aspecto de la invención, que la expresión de heparinasas no representa necesariamente una conmutación de un tumor primario a un estado de enfermedad metastásica. De acuerdo con el paradigma actual, se encontró actividad de heparinasa I para acelerar el crecimiento del tumor y se correlaciona con el aumento de la metástasis. Sorprendentemente, se encontró, sin embargo, que heparinasa III inhibe el crecimiento del tumor primario y reduce significativamente la metástasis. En un aspecto, la invención proporciona una heparinasa III modificada, sustancialmente pura, que comprende: un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo histidina, seleccionado del grupo que consiste en His36, His15, His11, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 y His539, ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina. La heparinasa III modificada de la invención se puede utilizar para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización, para uso en un método terapéutico para disminuir los síntomas de glaucoma neovascular, retinopatía diabética o fibropasia retrolental, en donde la heparinasa III modificada se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la aplicación tópica a los ojos, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de psoriasis, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la proliferación celular, para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la proliferación de un tumor, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales y el crecimiento del tumor, o para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la metástasis de células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera. En un aspecto, la invención es un método para prevenir el crecimiento de un tumor in vitro mediante la exposición de una célula tumoral a una cantidad eficaz de heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales con el fin de prevenir el crecimiento del tumor. En otros aspectos, la invención es un método para prevenir la metástasis de células tumorales mediante la exposición in vitro de una célula tumoral a una cantidad eficaz de heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera.

Adicionalmente, se ha descubierto de acuerdo con la invención que fragmentos de HLGAG terapéuticos pueden utilizarse para tratar el cáncer. Estos fragmentos son útiles para prevenir el crecimiento de un tumor,... [Seguir leyendo]

1. Una heparinasa III modificada, sustanclalmente pura, que comprende:

un pollpéptldo que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo hlstldlna seleccionado del grupo consistente en Hls36, His15, His11, His139, His152, His225, His234, His241, Hls424, Hls469 e Hls539 ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina.

2. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene al menos una sustitución dentro de un residuo histidina seleccionado del grupo consistente en His11, His139, His225 e His241.

3. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 2, en donde el polipéptido tiene una sustitución en His11, His139, His225 o His241.

4. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 3, en donde la His11, His139, His225 o His241 está sustituida con alanina.

5. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, inmovilizada sobre un soporte sólido.

6. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización.

7. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra a un tumor.

8. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra sistémicamente mediante inyección directa a un sitio de un tumor, o mediante aplicación directa durante la manipulación quirúrgica.

9. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la administración es por suministro oral o inyección.

1. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra en una cantidad eficaz para disminuir el número de vasos sanguíneos que crecen en un tumor.

11. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada es para tratar el cáncer, artritis reumatoide, glaucoma neovascular, artritis, retinopatía diabética, inflamación crónica, escleroderma, hemangioma, fibroplasia retrolental y proliferación capilar anormal en articulaciones hemofflicas, o trastornos del sistema reproductor femenino.

12. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de glaucoma neovascular, retinopatía diabética o fibroplasia retrolental, en donde la heparinasa III modificada se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la aplicación tópica al ojo.

13. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de la psoriasis.

14. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la proliferación celular.

15. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la proliferación de un tumor, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales y el crecimiento del tumor.

16. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se inyecta en el tumor in

vivo, se administra sistémicamente a un sujeto que tiene un tumor, o se administra oralmente a un sujeto que tiene un tumor.

17. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se administra

(a) en unión con un fármaco anti-cáncer; o

(b) sin fármacos anti-cáncer adicionales.

18. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se administr a un sujeto que tiene un tumor no metastásicocon el fin de prevenir que el tumor se vuelva metastásico.

19. Una heparinasa modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de próstata y melanoma.

2. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método in vivo para prevenir la metástasis de células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de la barrera.

21. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la metástasis de células tumorales según la reivindicación 2, en donde la heparinasa III modificada se administra in vivo en unión con un fármaco anti-cáncer.

22. Un método para prevenir la proliferación de un tumor in vitro, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para prevenir la proliferación de las células tumorales con el fin de prevenir el crecimiento del tumor.

23. Un método para prevenir la metástasis de células tumorales in vitro, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la barrera es una barrera in vitro de una membrana revestida con una matriz extracelular.

25. Una composición farmacéutica que comprende una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25, en donde dicha composición es un preparado farmacéutico que comprende una formulación estéril de una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

27. Un método de escindir específicamente un glicosaminoglicano similar a heparina in vitro, que comprende poner en contacto un glicosaminoglicano similar a heparina con una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, opclonalmente para producir LMWH.

28. Un método según la reivindicación 27, en el que el método es un método de separar fragmentos de HLGAG activos a partir de un fluido que contiene fragmentos de HLGAG.

29. Un método según la reivindicación 27, en el que la heparinasa lll modificada está inmovilizada sobre un soporte sólido.

3. Un método según la reivindicación 29, en el que el método es un método para secuenciar fragmentos de HLGAG.

31. Un método in vitro para preparar un fragmento de HLGAG terapéutico, que comprende poner en contacto un tumor aislado o una parte del mismo con una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para producir un fragmento de HLGAG e identificar el fragmento de HLGAG.

32. Un método según la reivindicación 31, que comprende, además, determinar la secuencia del fragmento de HLGAG.

33. Un método según la reivindicación 31, en el que el fragmento de HLGAG es terapéuticamente eficaz para:

(a) prevenir la proliferación de células tumorales o metástasis; o

(b) inhibir la neovascularización.

34. El método de la reivindicación 33, en el que la célula tumoral es de un tipo diferente de tumor que el tumor aislado o parte del mismo.

35. Un método según la reivindicación 31, en el que el tumor o parte del mismo es de cáncer del tracto biliar, cáncer 5 de cerebro, cáncer de mama, cáncer cervical, corlocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrlo, cáncer de

esófago, cáncer gástrico, neoplasia intraepitellal, llnfoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcoma, cáncer de piel, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer renal.

36. Un método según la reivindicación 35, en el que el tumor o parte del mismo es de cáncer de próstata o 1 melanoma.