Heparinasa III y sus usos.

Una heparinasa III modificada, sustancialmente pura, que comprende:



un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo histidina seleccionado del grupo consistente en His36, His105, His110, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 e His539 ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2001/007464.

Solicitante: MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 77 MASSACHUSETTS AVENUE CAMBRIDGE, MA 02139 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VENKATARAMAN,GANESH, SHRIVER,ZACHARY, SASISEKHARAN,RAM, DONGFANG,LIU, POJASEK,KEVIN, HOLLEY,KRISTINE, EL-SHABRAWI,YOSUF.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/715 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Polisacáridos, es decir que tienen más de cinco radicales sacáridos unidos los unos a los otros por enlaces glicosídicos; Sus derivados, p. ej. eteres, esteres.
  • A61K31/726 A61K 31/00 […] › Glicosaminoglicanos, es decir mucopolisacáridos (sulfato de condroitina, sulfato de dermatano A61K 31/737).
  • A61K38/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K38/51 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Liasas (4).
  • A61K45/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen ingredientes activos no previstos en los grupos A61K 31/00 - A61K 41/00.
  • A61K47/48 A61K […] › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores, aditivos inertes. › estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61P17/06 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 17/00 Medicamentos para el tratamiento de problemas dermatológicos. › para el tratamiento de la psoriasis.
  • A61P27/02 A61P […] › A61P 27/00 Medicamentos para tratar los trastornos de los sentidos. › Agentes oftálmicos.
  • A61P35/00 A61P […] › Agentes antineoplásicos.
  • A61P35/04 A61P […] › A61P 35/00 Agentes antineoplásicos. › específicos para la metástasis.
  • A61P9/00 A61P […] › Medicamentos para el tratamiento de trastornos en el aparato cardiovascular.
  • C08B37/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES.C08B POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que contienen menos de seis radicales sacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos C07H; procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas C12P 19/00; producción de celulosa D21). › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
  • C08B37/10 C08B […] › C08B 37/00 Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21). › Heparina; Sus derivados.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/60 C12N 15/00 […] › Liasas (4).
  • C12N9/24 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
  • C12N9/88 C12N 9/00 […] › Liasas (4.).
  • C12P19/26 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Preparación de hidratos de carbono que contienen nitrógeno.
  • C12P19/28 C12P 19/00 […] › N-glucósidos.
  • C12Q1/34 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una hidrolasa.
  • C12Q1/527 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una liasa.

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Fragmento de la descripción:

Heparinasa III y sus usos CAMPO DE LA INVENCIÓN

La Invención se refiere a formas modificadas de heparinasa III. En particular, la invención se refiere a formas modificadas de heparinasa III con actividad enzimática reducida, que son útiles para una diversidad de propósitos, Incluyendo la secuenclación de glicosaminoglicanos similares a heparina (HLGAGs - siglas en inglés), la separación de HLGAGs a partir de una disolución, la inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la coagulación, etc. La Invención, en otros aspectos, se refiere a formas modificadas de heparinasa III para tratar el cáncer e inhibir el crecimiento de células tumorales y/o metástasis o productos HLGAG producidos por escisión enzimática con formas modificadas de heparinasa III.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Glicosaminoglicanos similares a heparina (HLGAGs) son componentes importantes de la matriz extracelular, que se piensa que regulan una amplia diversidad de actividades celulares, incluyendo la invasión, migración, proliferación y adhesión. Khodapkar, et al. 1998; Woods, et al., 1998). Los HLGAGs logran algunas de estas funciones mediante uniéndose a y regulando las actividades biológicas de diversas moléculas, incluyendo factores de crecimiento, morfógenos, enzimas, proteínas extracelulares. Los HLGAGs son polisacáridos lineales que se caracterizan por una unidad repetitiva disacárido de un ácido uránico [ácido a-L-idurónico (I) o ácido (3-D-glucurónico (G)] enlazado a 1,4 a-B-hexosamina (H). (1) Estos polímeros de 2-1 unidades disacárido pueden modificarse adicionalmente a través de N- y O-sulfatación, epimerización en la posición C5 del resto de ácido uránico, añadiendo una micro- heterogeneidad adicional a estas moléculas de información densas. (1.5).

A pesar de que la estructura y la química de HLGAGs están bastante bien comprendidas, información sobre cómo secuencias de HLGAG específicas modulan diferentes procesos biológicos ha demostrado ser más difícil de obtener. Los autores de la invención han desarrollado recientemente una metodología de secuenciación rápida para polisacáridos utilizando herramientas químicas y enzimáticas para modificar o degradar un polímero de HLGAG desconocido de una manera específica para la secuencia. (Venkataraman, G., et al., Science, 286,537-542 (1999), y Solicitudes de Patente de EE.UU. N° de serie. 9/557.997 y 9/558.137, ambas presentadas el 24 de abril de 2). Una herramienta enzimática Importante en este proceso de secuenciación son las heparinasas, incluyendo heparinasas I, II y III. Las tres heparinasas son enzimas de degradación de HLGAG que se pueden producir por parte de Flavobacterum heparinum. Cada una de los heparinasas tiene su propia secuencia de HLGAG única en la que se escinde, haciendo de estas enzimas valiosas herramientas para obtener una información específica de la secuencia. La heparinasa I escinde principalmente HLGAGs en el enlace HNs,6x-l2s2 que se encuentra principalmente en las reglones similares a heparina (Ernst, S., et al., Crit, Rev. Biochem. Mol. Biol., 3, 387-444 (1995)). Desal, U., et al., Biochemistry 32, 814-8145 (1993)), y Jandik, K., et al., Glycobiology, 4, 289-296 (1994)). La heparinasa III escinde en los enlaces Hnac-I y Hny,6x-G2 que son los principales disacáridos encontrados en el sulfato de heparán (Ernst, et al., (1995), supra, y Linhardt, R., et al., Biochemistry, 29, 2611-2617 (199)). La heparinasa II es capaz de reconocer y escindir ambos conjuntos de enlaces de sustrato (Ernst, etal., (1995), supra). Recientemente, los autores de la invención han identificado varios residuos que son críticos para la actividad de heparinasa I y heparinasa II. Se encontró que la cisteína 135 y la histidina 23, así como las lisinas 198, 199 y 132 de heparinasa I eran críticas para la actividad enzimática de la molécula. Se determinó que la cisteína 348 y las hlstldlnas 238, 451 y 579 eran cruciales para la actividad heparinasa II. (Solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación, N° 9/384.959; Sasisekharan, R., et al., Biochemistry, 34, 14441-14448 (1995); Godavarti, R., et al., Biochemistry, 35, 6846-6852 (1996); Godavarti, R., y Sasisekharan, R., J. Biol. Chem. 273, 248-255 (1998); Shriver, Z., et al, J. Biol. Chem., 273, 2294-22912 (1998); y Shriver, Z., J. Biol. Chem., 273, 116-1167 (1998)).

La heparinasa III es única, ya que es el único miembro de la familia de la heparinasa que reconoce y escinde preferencialmente sulfato de heparán. La heparinasa III tampoco contiene cisteínas en su secuencia de aminoácidos.

La metástasis de tumores implica la propagación de células tumorales principalmente a través de la vasculatura a sitios remotos en el cuerpo. Se piensa que a medida que la matriz extracelular se degrada, las interacciones célula tumoral-matriz extracelular se desensamblan, liberando la célula tumoral para atravesar el lecho capilar. Se han logrado avances extraordinarios para dilucidar los roles de colágeno y proteínas relacionadas, enzimas (colagenasas y otras) que degradan las proteínas de la matriz extracelular para regular la angiogénesis tumoral y/o invasión de células tumorales.

Recientemente también se ha planteado la hipótesis de que enzimas que degradan HLGAG, heparinasas, ayudan en la degradación de la matriz extracelular para regular el crecimiento del tumor, la angiogénesis y la metástasis. Se ha sugerido que la expresión de heparinasas en asociación con el desarrollo de tumores representa una

conmutación de un tumor metastásico a un tumor no metastásico y desempeña un papel en la Iniciación del proceso de metástasis. La hipótesis fue reafirmada por la reciente clonación de un gen humano heparinasa y por la demostración de una malignidad incrementada de las células cancerosas mediante la sobre-expresión del producto del gen de la heparinasa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto, de acuerdo con un aspecto de la invención, que la expresión de heparinasas no representa necesariamente una conmutación de un tumor primario a un estado de enfermedad metastásica. De acuerdo con el paradigma actual, se encontró actividad de heparinasa I para acelerar el crecimiento del tumor y se correlaciona con el aumento de la metástasis. Sorprendentemente, se encontró, sin embargo, que heparinasa III inhibe el crecimiento del tumor primario y reduce significativamente la metástasis. En un aspecto, la invención proporciona una heparinasa III modificada, sustancialmente pura, que comprende: un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo histidina, seleccionado del grupo que consiste en His36, His15, His11, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 y His539, ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina. La heparinasa III modificada de la invención se puede utilizar para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización, para uso en un método terapéutico para disminuir los síntomas de glaucoma neovascular, retinopatía diabética o fibropasia retrolental, en donde la heparinasa III modificada se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la aplicación tópica a los ojos, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de psoriasis, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la proliferación celular, para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la proliferación de un tumor, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales y el crecimiento del tumor, o para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la metástasis de células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera. En un aspecto, la invención es un método para prevenir el crecimiento de un tumor in vitro mediante la exposición de una célula tumoral a una cantidad eficaz de heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales con el fin de prevenir el crecimiento del tumor. En otros aspectos, la invención es un método para prevenir la metástasis de células tumorales mediante la exposición in vitro de una célula tumoral a una cantidad eficaz de heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera.

Adicionalmente, se ha descubierto de acuerdo con la invención que fragmentos de HLGAG terapéuticos pueden utilizarse para tratar el cáncer. Estos fragmentos son útiles para prevenir el crecimiento de un tumor,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una heparinasa III modificada, sustanclalmente pura, que comprende:

un pollpéptldo que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde al menos un residuo hlstldlna seleccionado del grupo consistente en Hls36, His15, His11, His139, His152, His225, His234, His241, Hls424, Hls469 e Hls539 ha sido sustituido con un residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, tirosina, treonina y lisina.

2. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene al menos una sustitución dentro de un residuo histidina seleccionado del grupo consistente en His11, His139, His225 e His241.

3. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 2, en donde el polipéptido tiene una sustitución en His11, His139, His225 o His241.

4. Una heparinasa III modificada según la reivindicación 3, en donde la His11, His139, His225 o His241 está sustituida con alanina.

5. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, inmovilizada sobre un soporte sólido.

6. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización.

7. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra a un tumor.

8. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra sistémicamente mediante inyección directa a un sitio de un tumor, o mediante aplicación directa durante la manipulación quirúrgica.

9. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la administración es por suministro oral o inyección.

1. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada se administra en una cantidad eficaz para disminuir el número de vasos sanguíneos que crecen en un tumor.

11. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización según la reivindicación 6, en donde la heparinasa III modificada es para tratar el cáncer, artritis reumatoide, glaucoma neovascular, artritis, retinopatía diabética, inflamación crónica, escleroderma, hemangioma, fibroplasia retrolental y proliferación capilar anormal en articulaciones hemofflicas, o trastornos del sistema reproductor femenino.

12. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de glaucoma neovascular, retinopatía diabética o fibroplasia retrolental, en donde la heparinasa III modificada se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la aplicación tópica al ojo.

13. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para disminuir los síntomas de la psoriasis.

14. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para inhibir la proliferación celular.

15. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método terapéutico in vivo para prevenir la proliferación de un tumor, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la proliferación de las células tumorales y el crecimiento del tumor.

16. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se inyecta en el tumor in

vivo, se administra sistémicamente a un sujeto que tiene un tumor, o se administra oralmente a un sujeto que tiene un tumor.

17. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se administra

(a) en unión con un fármaco anti-cáncer; o

(b) sin fármacos anti-cáncer adicionales.

18. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde la heparinasa III modificada se administr a un sujeto que tiene un tumor no metastásicocon el fin de prevenir que el tumor se vuelva metastásico.

19. Una heparinasa modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la proliferación de un tumor según la reivindicación 15, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de próstata y melanoma.

2. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en un método in vivo para prevenir la metástasis de células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de la heparinasa III modificada para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de la barrera.

21. Una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en prevenir la metástasis de células tumorales según la reivindicación 2, en donde la heparinasa III modificada se administra in vivo en unión con un fármaco anti-cáncer.

22. Un método para prevenir la proliferación de un tumor in vitro, que comprende exponer células tumorales a una cantidad eficaz de una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para prevenir la proliferación de las células tumorales con el fin de prevenir el crecimiento del tumor.

23. Un método para prevenir la metástasis de células tumorales in vitro, que comprende exponer una célula tumoral a una cantidad eficaz de una heparinasa III modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para prevenir la invasión de la célula tumoral a través de una barrera.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la barrera es una barrera in vitro de una membrana revestida con una matriz extracelular.

25. Una composición farmacéutica que comprende una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25, en donde dicha composición es un preparado farmacéutico que comprende una formulación estéril de una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

27. Un método de escindir específicamente un glicosaminoglicano similar a heparina in vitro, que comprende poner en contacto un glicosaminoglicano similar a heparina con una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, opclonalmente para producir LMWH.

28. Un método según la reivindicación 27, en el que el método es un método de separar fragmentos de HLGAG activos a partir de un fluido que contiene fragmentos de HLGAG.

29. Un método según la reivindicación 27, en el que la heparinasa lll modificada está inmovilizada sobre un soporte sólido.

3. Un método según la reivindicación 29, en el que el método es un método para secuenciar fragmentos de HLGAG.

31. Un método in vitro para preparar un fragmento de HLGAG terapéutico, que comprende poner en contacto un tumor aislado o una parte del mismo con una heparinasa lll modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para producir un fragmento de HLGAG e identificar el fragmento de HLGAG.

32. Un método según la reivindicación 31, que comprende, además, determinar la secuencia del fragmento de HLGAG.

33. Un método según la reivindicación 31, en el que el fragmento de HLGAG es terapéuticamente eficaz para:

(a) prevenir la proliferación de células tumorales o metástasis; o

(b) inhibir la neovascularización.

34. El método de la reivindicación 33, en el que la célula tumoral es de un tipo diferente de tumor que el tumor aislado o parte del mismo.

35. Un método según la reivindicación 31, en el que el tumor o parte del mismo es de cáncer del tracto biliar, cáncer 5 de cerebro, cáncer de mama, cáncer cervical, corlocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrlo, cáncer de

esófago, cáncer gástrico, neoplasia intraepitellal, llnfoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcoma, cáncer de piel, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer renal.

36. Un método según la reivindicación 35, en el que el tumor o parte del mismo es de cáncer de próstata o 1 melanoma.


 

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