Conjugados de anticuerpo anti-CD70-fármaco y su uso para el tratamiento de cáncer y trastornos inmunológicos.

Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que se une a CD70 y un fármaco que es un agente citotóxico seleccionado de un agente de unión al surco menor del ADN,

un agente alquilante o un agente anti-tubulina, y en donde

(i) el anticuerpo compite por la unión a CD70 con

(a) un anticuerpo monoclonal IF6 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los restos 20-137 de SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los restos 21-132 de SEQ ID NO: 12; o

(b) un anticuerpo monoclonal 2F2 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los restos 20-137 de SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en 21-132 SEQ NO: 32; o

(ii) el anticuerpo que comprende las regiones H1, H2, y H3 de SEQ ID NOS: 6, 8 y 10 y que compren de además las regiones L1, L2, y L3 de SEQ ID NOS: 16, 18 y 20; o

el anticuerpo que comprende las regiones H1, H2, y H3 de SEQ ID NOS: 26,28 y 30 y que comprende además las regiones L1, L2, y L3 de SEQ ID NOS: 36, 38 y 40; o

(iii) el anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos enunciada en los restos 20-137 de SEQ NO: 2 o SEQ ID NO: 22, y una región variable de cadena ligera que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 32.

Conjugados de anticuerpo anti-CD70-fármaco y su uso para el tratamiento de cáncer y trastornos inmunológicos Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/449, 055, presentada el 20 5 de febrero de 2003.

Antecedentes de la invención CD70 es un miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (TNF) de moléculas asociadas a membranas celulares y secretadas que son expresadas por una diversidad de tipos celulares normales y malignos. La secuencia primaria de aminoácidos (AA) de CD70 predice una proteína transmembrana de tipo II con su extremo carboxilo 10 expuesto al exterior de las células, y su extremo amino localizado en el lado citosólico de la membrana plasmática (Bowman et al., 1994, J Immunol 152:1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56) . El CD70 humano está compuesto de un dominio citoplasmático de 20 AA, un dominio transmembrana de 18 AA, y un dominio extracitoplasmático de 155 AA con dos sitios potenciales de N-glicosilación (Bowman et al., anteriormente mencionado; Goodwin et al., anteriormente mencionado) . La inmunoprecipitación específica de células que expresan CD70

marcadas con radioisótopos mediante anticuerpos anti-CD70 produce polipéptidos de 29 y 50 kDa (Goodwin et al., anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1994, J Immunol 152:1762-73) . Basándose en su homología respecto de TNF-α y TNF-β, en especial en las cadenas estructurales C, D, H e I, se predice una estructura trimérica para CD70 (Petsch et al., 1995, Mol Immunol 32:761-72) .

Los estudios inmunohistológicos originales revelaron que CD70 se expresa en las células B de los centros germinales y en pocas células T en amígdalas, piel, e intestino (Hintzen et al., 1994, Int Immunol 6:477-80) . Posteriormente, se informó que CD70 se expresa en la superficie celular de linfocitos T y B recién activados por antígenos, y su expresión decae tras la retirada de la estimulación antigénica (Lens et al., 1996, Eur J Immunol 26:296471; Lens et al., 1997, Immunology 90:38-45) . En el sistema linfoide, las células citotóxicas (Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107:608-13) y las células dendríticas periféricas maduras de ratón (Akiba et al., 2000, J Exp Med

191:375-80) también expresan CD70. En los linajes que no son linfoides, se ha detectado CD70 en las células epiteliales medulares del timo (Hintzen et al., 1994, anteriormente mencionado; Hishima et al., 2000, Am J Surg Pathol 24:742-46) .

Además de la expresión en células normales, se ha informado de la expresión de CD70 en diferentes tipos de cánceres, que incluyen linfomas, carcinomas, y tumores de origen neural. En las células B malignas, se ha 30 informado que un 71% de los linfomas de células B grandes difusos, un 33% de los linfomas foliculares, un 25% de los linfomas del manto, y un 50% de los B-CLL expresan CD70 (Lens et al., 1999, Br J Haematol 106:491-503) . CD70 se expresa con frecuencia junto con otros marcadores de activación linfoides en las células malignas de Hodgkin y de Reed-Sternberg de la enfermedad de Hodgkin (Gruss y Kadin, 1996, Bailieres Clin Haematol 9:41746) . Un informe demuestra la expresión de CD70 en un 88% (7 de 8 casos) de carcinomas tímicos y un 20% (1 de 5 35 casos) de timomas atípicos (Hishima et al., 2000, anteriormente mencionado) . El segundo tipo de carcinoma en el que se ha detectado CD70 es el carcinoma nasofaríngeo. Un estudio informa de la presencia de CD70 en el 80% (16 de 20 casos) de biopsias de tumores congeladas rápidamente obtenidas de carcinomas nasofaríngeos indiferenciados (Agathanggelou et al., 1995, Am J Path 147:1152-60) . También se ha detectado CD70 en células de tumores cerebrales, en especial en líneas celulares de gliomas, gliomas humanos sólidos, y meningiomas (Held

Feindt y Mentlein, 2002, Int J Cancer 98:352-56; Wischlusen et al., 2002, Can Res 62:2592-99) .

Se ha propuesto que los virus transformantes, que incluyen el virus de Epstein-Barr (EBV) y el virus de la leucemia T humana 1 (HTLV-1) pueden inducir CD70 en células tales como las células epiteliales, que normalmente no expresan CD70 (Agathanggelou et al., anteriormente mencionado; Stein et al., 1989, Oxford University Press, pág. 446) . Por lo tanto, la expresión de CD70 en las células B malignas podría ser un reflejo de una transformación 45 oncogénica (Lens et al., 1999, anteriormente mencionado) . Además, debido a que la expresión de CD70 se induce en las células B tras el encuentro con un antígeno (Maurer et al., 1990, Eur J Immunol 20:2679-84; Lens et al., 1996, anteriormente mencionado) , la expresión estable de CD70 podría reflejar una estimulación antigénica prolongada. Se ha postulado que esto ocurre en los linfomas no Hodgkin foliculares basándose en una hipermutación somática en desarrollo (Bahler et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:6770-74; Bahler et al., 1992, Cancer Res 52:supl.

5547S-51S) .

El receptor de CD70 es CD27, una proteína transmembrana de tipo I glicosilada de alrededor de 55 kDa (Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56; Hintzen et al., 1994, anteriormente mencionado) . CD70 se denomina a veces CD27L. CD27, que existe en forma de un homodímero en la superficie celular (Gravestein et al., 1993, Eur J Immunol 23:943-50) , es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF tal como se define por las repeticiones ricas en 55 cisteína de alrededor de 40 aminoácidos en el dominio extracelular (Smith et al., 1990, Science 248:1019-23; Locksley et al., 2001, Cell 104:487-501) . CD27 se expresa típicamente en los timocitos, en las células citotóxicas, y en las células T y B (Hintzen et al., 1994, Immunol Today 15:307-11; Lens et al., 1998, Semin Immunol 10:491-99) . En las células T en reposo, CD27 se expresa de manera constitutiva, aunque el desencadenamiento antigénico estimula adicionalmente la expresión de CD27 (de Jong et al., 1991, J Immunol 146:2488-94; Hintzen et al., 1993, J Immunol. 151:2426-35) . Además, el desencadenamiento de las células T a través de su complejo antígeno-receptor de células T solo o en combinación con la molécula secundaria CD28 libera CD27 soluble de las células T activadas (Hintzen et al., 1991, J Immunol 147:29-35) . Las células B sin exposición previa no expresan CD27, pero su expresión se induce y, al contrario de CD70, se mantiene tras el desencadenamiento antigénico de las células B (Jacquot S et al., 1997 J Immunol 159:2652-57; Kobata T et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11249-53) .

En contraste notable con la expresión limitada de CD27 y CD70 en células normales de linaje B, tanto CD27 como CD70 se co-expresan frecuentemente en muchos linfomas no Hodgkin y leucemias de células B. Esto podría conducir potencialmente a interacciones funcionales CD27-CD70 en estas células en forma de un bucle autocrino, lo que daría como resultado la señalización de CD27 y la proliferación inducida por CD70, por lo que se proporcionaría una ventaja de crecimiento a las células malignas (Lens et al., 1999, anteriormente mencionado) .

Los datos disponibles apoyan un modelo en el que la unión de CD27 en los linfocitos activados mediante CD70 comunica señales a las células que expresan CD27, lo que incluye señales co-estimuladoras en las células T, B, y citotóxicas (véase, p.ej., Goodwin et al., anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1995, J Immunol 154:2612-23; Oshima et al., 1998, Int Immunol 10:517-26; Smith et al., anteriormente mencionado; Van Lier et al., 1987, J Immunol 139:1589-96; Gravestein et al., 1995, Int Immunol 7:551-7; Tesselaar et al., 1997, J Immunol 159:4959-65; Jacquot et al., anteriormente mencionado; Agematsu et al., 1998, Blood 91:173-80; Kobata et al., anteriormente mencionado; Agematsu et al., 1997, Eur J Immunol 27:2073-79; Sugita et al., 1992, J Immunol 149:1199-1203; Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107:608-13) . Se ha demostrado que los anticuerpos contra CD70 murino y humano inhiben dichas actividades, supuestamente bloqueando la interacción CD70/CD27 (Hintzen et al., 1994, anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1995, anteriormente mencionado; Oshima et al., anteriormente mencionado) .

Hay disponible una información limitada sobre la modulación de las funciones celulares por medio de la señalización de CD70 tras la interacción CD70/CD27, es decir, la "señalización inversa". Algunos anticuerpos de CD70 tienen la capacidad de de aumentar la proliferación de las células T cuando se presentan a las células T que expresan CD70, entrecruzados con un anticuerpo secundario o inmovilizados en placas de cultivo de tejidos (Bowman et al., 1994, J Immunol 152:1756-61; Brugnoni, 1997, Immunol Lett 55:99-104) . Tal "señalización inversa" se ha descrito también... [Seguir leyendo]

1.Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que se une a CD70 y un fármaco que es un agente citotóxico seleccionado de un agente de unión al surco menor del ADN, un agente alquilante o un agente anti-tubulina, y en donde

(i) el anticuerpo compite por la unión a CD70 con

(a) un anticuerpo monoclonal IF6 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los resto.

2. 137 de SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los resto.

2. 132 de SEQ ID NO: 12; o

(b) un anticuerpo monoclonal 2F2 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada en los resto.

2. 137 de SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos enunciada e.

2. 132 SEQ NO: 32; o

(ii) el anticuerpo que comprende las regiones H1, H2, y H3 de SEQ ID NOS: 6, 8 y 10 y que compren de además las regiones L1, L2, y L3 de SEQ ID NOS: 16, 18 y 20; o

el anticuerpo que comprende las regiones H1, H2, y H3 de SEQ ID NOS: 26, 28 y 30 y que comprende además las regiones L1, L2, y L3 de SEQ ID NOS: 36, 38 y 40; o (iii) el anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos enunciada en los resto.

2. 137 de SEQ NO: 2 o SEQ ID NO: 22, y una región variable de cadena ligera que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 32.

2.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco se selecciona del grupo que consiste en 1F6-val-cit-AFP, 1F6-val-cit-MMAE, 2F2-val-cit-AFP, y 2F2-val-cit-MMAE, o una forma quimérica o humanizada del mismo.

3.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

4.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano 5.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

6.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una auristatina, una enediina, una lexitropsina, una duocarmicina, un taxano, una dolastatina, un mautansinoide y un alcaloide de la vinca.

7.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el agente citotóxico es AFP, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, morfolinodoxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretastatina, calicheamicina, maitansina, DM-1, o eleuterobina.

8.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el agente citotóxico es un agente anti-tubulina.

9.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el agente citotóxico es una auristatina, un alcaloide de la vinca, una podofilotoxina, un taxano, un derivado de baccatina, una criptofisina, un maitansinoide, una combretastatina, o una dolastatina, o el agente antitubulina es AFP, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcimida, cemadotina, discodermolida, maitansina, DM-1, o eleuterobina.

10.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está conjugado con el agente citotóxico por medio de un enlazador.

11.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en el que el enlazador es escindible en las condiciones intracelulares, preferiblemente un enlazador peptídico escindible mediante una proteasa intracelular, por ejemplo, el enlazador peptídico es un enlazador dipeptídico, tal como el enlazador dipeptídico comprende un enlazador val-cit o un péptido phe-lys.

12.El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 11, en el que el enlazador escindible es hidrolizable a un pH menor que 5, 5 o donde el enlazador hidrolizable es un enlazador de hidrazona, o donde el enlazador escindible es un enlazador de disulfuro.