Composición para el análisis de proteínas glicosiladas.

Composición para el análisis de proteínas glicosiladas que comprende una proteasa y una enzima que reacciona,

como mínimo, con un aminoácido glicosilado, caracterizada porque la proteasa está presente junto con, 1) como mínimo, uno seleccionado del grupo que comprende ácido desoxicólico, amida de ácido desoxicólico, amida de ácido cólico, octil glucósido, sal de amonio cuaternario, tensioactivo catiónico de tipo sal de amonio cuaternario, concanavalina A, y betaína, y/o

2) ácido ascórbico oxidasa y un agente de tampón que no tiene un grupo 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilo, en la que dicha enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es fructosil-aminoácido-oxidasa (FOD).

Composición para el análisis de proteínas glicosiladas Sector técnico La presente invención se refiere a una composición para el análisis de proteínas glicosiladas y a un método de análisis de proteínas glicosiladas. La composición y el método de análisis de proteínas glicosiladas de la presente invención se puede utilizar en exámenes clínicos y puede determinar proteínas glicosiladas de manera precisa.

Antecedentes de la técnica La determinación de proteínas glicosiladas es muy importante en el diagnóstico y control de la diabetes. La hemoglobina glicosilada (GHb) , que refleja un valor promedio de glucosa en sangre aproximadamente en los 1-2 meses anteriores, la albúmina glicosilada (GA) , que refleja un valor promedio de glucosa en sangre aproximadamente en las dos semanas anteriores, la fructosamina (FRA) , que generalmente indica proteínas glicosiladas que exhiben capacidad de reducción en el suero sanguíneo y similares, se miden a diario. La GHb es un producto glicosilado de la hemoglobina, es decir, el grupo α-amino de la valina del extremo N en la cadena β de la hemoglobina está glicosilado. GA y FRA son productos glicosilados de albúmina y proteína de suero sanguíneo, respectivamente, es decir, el grupo ε-amino de un residuo de lisina de la albúmina o de la proteína de suero sanguíneo está glicosilado.

Un método enzimático se considera como un método sencillo, fácil y barato para analizar con precisión proteínas glicosiladas. Las solicitudes de Patente Japonesas abiertas a Inspección Pública Núm. 6-46846, Núm. 5-192193, Núm. 2-195900, y Núm. 2-195899, y las Solicitudes de Patente Internacional Núm. WO 98/48043, y WO 97/13872 se indican como ejemplos de documentos que dan a conocer el método enzimático.

Sin embargo, para proporcionar una composición para analizar con precisión proteínas glicosiladas, es esencial 1) evitar el efecto de los componentes de globulinas y el ácido ascórbico y 2) estabilizar las proteasas, como mínimo, la enzima que reacciona con los aminoácidos glicosilados. Además, en el caso en el que la proteína glicosilada es una albúmina glicosilada, es importante 3) analizar con precisión la albúmina y 4) evitar el efecto de la hemoglobina glicosilada.

1) Métodos convencionales para evitar el efecto de los componentes de globulinas y el ácido ascórbico Es sabido que la cantidad de globulinas de un diabético cambia y afecta al valor de FRA [Rodrigues, S. y otros, Clin. Chem. 35: 134-138 (1989) ]. Los presentes inventores han desarrollado un método para inhibir selectivamente la acción de una proteasa sobre los componentes de globulinas mediante la adición de un ión metálico específico y una proteína A o G a una solución de reacción de proteasas (Solicitud de Patente Japonesa Núm 11-231259) . Las proteínas glicosiladas pueden analizarse sin ser afectadas por los componentes de globulina utilizando el método de la presente invención. Como inhibidor de proteasas selectivo para globulinas utilizado en el método, se mencionan metales, proteína A, y proteína G. Entre los metales especificados en esta solicitud de patente, son metales altamente eficaces los metales pesados, que pueden tener problemas de seguridad ambiental. Los metales menos eficaces pueden hacer que la solución de reactivos se enturbie si se combina con otros reactivos (o composiciones) . Además, la proteína A, y la proteína G son reactivos muy caros.

Como método para adsorber de forma selectiva globulina en sangre, es conocido un agente de tratamiento de la sangre que adsorbe endotoxinas y globulina en sangre utilizando el principio de la cromatografía y un copolímero de vinilo que introdujo un ligando que tiene un esqueleto de esteroide (Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 61-94663) . Sin embargo, los resultados mostrados en la Tabla 1 de los ejemplos de la Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 61-94663 indican que sólo se confirmó que fueron adsorbidas α1-globulina y α2-globulina, pero la γ-globulina que representa el 70% o más de los componentes de globulina no fue adsorbida. Suponiendo que la γ-globulina fuera adsorbida, no puede anticiparse la capacidad del agente de tratamiento de la sangre de inhibir la actividad de las proteasas sobre la γ-globulina.

Las ocasiones en que se ingiere una gran cantidad de ácido ascórbico como suplemento han aumentando en los últimos años. Las muestras clínicas que contienen ácido ascórbico a elevada concentración también han aumentado. El ácido ascórbico induce una serie de efectos sobre los exámenes clínicos debido a la fuerte acción de reducción.

Como método para obviar los efectos del ácido ascórbico, es conocido un método de eliminación de forma química o enzimática del ácido ascórbico en muestras, utilizando una oxidasa de ácido ascórbico. Cuando se analizan los aminoácidos glicosilados, producidos por la fragmentación de las proteínas glicosiladas con una proteasa utilizando una enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es preferente un método de previa eliminación de ácido ascórbico, utilizando una oxidasa de ácido ascórbico (ASOx) en el momento de la reacción con

una proteasa, en vista de su reducido efecto sobre el sistema de coloración.

Como ejemplo de eliminación de ácido ascórbico en muestras utilizando ASOx en presencia de una proteasa, se ha informado de un experimento en el que se hace reaccionar ASOx con una solución de muestra en una solución tampón de ácido 2-[4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil]etano sulfónico (HEPES) a pH 8, 0 (Clinical Chemistr y , 27: 99-106, 1998) . El informe describe que la capacidad de tratamiento del ácido ascórbico no cambió después de almacenamiento en frío durante dos semanas.

Sin embargo, la investigación realizada por los autores de la presente invención ha revelado que, cuando están presentes una solución tampón HEPES a pH 8, 0, una proteasa y ASOx, la capacidad de tratamiento del ácido ascórbico se pierde casi en su totalidad en un día cuando se almacena a 37º C, o en dos semanas cuando se almacena a 10º C.

2) Técnica anterior para la estabilización de proteasas y enzimas que reaccionan, como mínimo, con un aminoácido glicosilado Una solución de proteasas a una concentración inconcebiblemente alta, de un nivel que no se conoce en otro sector, tal como la industria alimentaria, se utiliza en el análisis clínico de proteínas glicosiladas. Es sabido que las proteasas se auto-digieren en una solución acuosa. Es difícil suponer que una proteasa se mantiene estable en una solución acuosa a una concentración tan elevada. Por lo tanto, las proteasas utilizadas para una composición para analizar proteínas glicosiladas han sido suministradas como producto liofilizado.

No han existido composiciones para analizar proteínas glicosiladas, ni un método de análisis de proteínas glicosiladas, en los que se estabilice una proteasa en estado líquido y que sea almacenable durante un largo período de tiempo. Tampoco ha habido ninguna composición para analizar proteínas glicosiladas, ni un método de análisis de proteínas glicosiladas en los que la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, se estabilice en estado líquido y sea almacenable durante un largo período de tiempo.

3) Técnica anterior relacionada con un método para el análisis preciso de albúmina La inmunización con anticuerpos anti-albúmina y un método de tinción que utiliza verde de bromocresol (BCG) , púrpura de bromocresol (BCP) , o similares, se conocen como métodos para determinar la albúmina. El método de tinción es ampliamente utilizado en las inspecciones diarias debido a que es un procedimiento sencillo y de bajo coste. Aunque se ha confirmado el efecto del BCG sobre el componente de globulina, el BCG presenta la desventaja de una baja especificidad para la albúmina.

Por otro lado, el BCP es afectado fácilmente por sustancias que coexisten, a pesar de la alta especificidad para la albúmina. En particular, el BCP es afectado por compuestos SH, dando lugar a un problema de variación en los resultados del análisis, según las condiciones de oxidación-reducción de la albúmina. Como un medio para resolver este problema, se ha propuesto un método en el que se hace reaccionar el BCP en presencia de un agente desnaturalizante de proteínas y/o un reactivo SH (Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 10-232233) . Sin embargo, no ha habido ejemplos en el estudio de la reactividad de BCP para GA y albúmina no glicosilada (NGA) .

4) Técnica anterior para evitar el efecto de la hemoglobina glicosilada Tal... [Seguir leyendo]

1. Composición para el análisis de proteínas glicosiladas que comprende una proteasa y una enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, caracterizada porque la proteasa está presente junto con,

1) como mínimo, uno seleccionado del grupo que comprende ácido desoxicólico, amida de ácido desoxicólico, amida de ácido cólico, octil glucósido, sal de amonio cuaternario, tensioactivo catiónico de tipo sal de amonio cuaternario, concanavalina A, y betaína, y/o 2) ácido ascórbico oxidasa y un agente de tampón que no tiene un grupo 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinilo, en la que dicha enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es fructosil-aminoácido-oxidasa (FOD) .

2. Composición, según la reivindicación 1, en la que la amida de ácido desoxicólico es bisgluconamidopropildesoxicolamida, y la amida de ácido cólico es ácido 3-[ (3-colamidopropil) dimetilamonio] propano sulfónico, ácido 3-[ (3-colamidopropil) dimetilamonio]-2-hidroxipropano sulfónico, o bisglucoamidopropilcolamida.

3. Composición, según la reivindicación 1, en la que el agente de tampón, que no tiene un grupo 4- (2-hidroxietil) -1piperazinilo es trishidroximetilaminometano o ácido piperazin-1, 4-bis (2-hidroxi-3-propano sulfónico) .

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la proteína glicosilada es albúmina glicosilada, incluyendo la composición por separado una composición para el análisis de albúmina, y la composición determina la proporción de glicosilación de la albúmina, en la que la composición para el análisis de albúmina comprende un agente de desnaturalización de proteínas y/o un compuesto que tiene un enlace S-S y púrpura de bromocresol, en la que dicho agente de desnaturalización de proteínas se selecciona del grupo que comprende urea, compuestos de guanidina, lauril sulfato de sodio (SDS) , sulfato de polietilen alquilfenil éter, sulfato de polioxietilen alquil éter, y sulfonato de alquil benceno.

5. Composición, según la reivindicación 4, en la que el agente de desnaturalización de proteínas y/o el compuesto que tiene un enlace S-S es ácido 2, 2´-ditiodibenzoico, 4, 4´-ditiodimorfolina, disulfuro de 2, 2´-dihidroxi-6, 6´-dinaftilo (DDD) , 2, 2´-ditiopiridina (2-PDS) , 4, 4´-ditiopiridina (4-PDS) , 5, 5´-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) , o lauril sulfato de sodio.

6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que se añade a la proteasa un estabilizador de proteasas seleccionado del grupo que comprende dimetilsulfóxido, alcohol, cloruro de sodio, sal de amonio cuaternario, y tensioactivo catiónico de tipo sal de amonio cuaternario.

7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que se añade a la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, un estabilizador para la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, seleccionado del grupo que comprende un alcohol de azúcar, sacarosa, sal de magnesio soluble en agua, sal de calcio soluble en agua, sulfato de amonio, aminoácido, y sarcosina.

8. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la proteasa se obtiene de un microorganismo que pertenece al género Bacillus.

9. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado es una fructosil aminoácido oxidasa mutante de la que la se ha disminuido significativamente la reactividad con la valina glicosilada mediante la sustitución de la lisina 372 en la secuencia de aminoácidos indicada en el listado de secuencias Secuencia ID NO: 1 por otro aminoácido.

10. Composición, según la reivindicación 9, en la que se utiliza como otro aminoácido la fructosil aminoácido oxidasa mutante sustituida con triptófano, metionina, o valina.

11. Composicón, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la composición es un producto líquido.

12. Procedimiento para el análisis de proteínas glicosiladas que utiliza una proteasa y una enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, caracterizada poque la proteasa se hace reaccionar

1) en presencia, como mínimo, de un miembro seleccionado del grupo que comprende ácido desoxicólico, amida de ácido desoxicólico, amida de ácido cólico, sal de amonio cuaternario, tensioactivo catiónico de tipo sal de amonio cuaternario, concanavalina A, y betaína, para disminuir la reactividad de la proteasa con los componentes de globulinas y/o

2) una ácido ascórbico oxidasa se hace reaccionar en un agente de tampón que no tiene un grupo 4- (2hidroxietil) -1-piperazinilo para eliminar el ácido ascórbico y de forma simultánea digerir proteínas, en la que dicha enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es fructosil-aminoácido-oxidasa (FOD) .

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que la amida de ácido desoxicólico es bisgluconamidopropildesoxicolamida, y la amida de ácido cólico es ácido 3-[ (3-colamidopropil) dimetilamonio]propano sulfónico, ácido 3-