Composición para el ensayo de proteínas glicosiladas.

Método de ensayo de proteínas glicosiladas utilizando una proteasa y una enzima que reacciona,

como mínimo,con un aminoácido glicosilado, que comprende hacer reaccionar la muestra con la enzima que reacciona, comomínimo, con un aminoácido glicosilado y, a continuación, con la proteasa, en 5 el que se excluyeque se añade una fructosil-aminoácido-oxidasa a la muestra después de hacer reaccionar la muestra con laproteasa, en el caso que la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es fructosilaminoácido-oxidasa.

Composición para el ensayo de proteínas glicosiladas

Sector técnico

La presente invención se refiere a un método de ensayo de proteínas glicosiladas. El método de ensayo de proteínas glicosiladas de la presente invención se puede utilizar en exámenes clínicos y puede determinar proteínas glicosiladas de manera precisa.

Antecedentes de la técnica

La determinación de proteínas glicosiladas es muy importante en el diagnóstico y control de la diabetes. La hemoglobina glicosilada (GHb) , que refleja un valor promedio de glucosa en sangre aproximadamente en los 1-2 meses anteriores, la albúmina glicosilada (GA) , que refleja un valor promedio de glucosa en sangre aproximadamente en las dos semanas anteriores, la fructosamina (FRA) , que generalmente indica proteínas glicosiladas que exhiben capacidad de reducción en el suero sanguíneo y similares, se miden a diario. La GHb es un producto glicosilado de la hemoglobina, es decir, el grupo a-amino de la valina del extremo N en la cadena º de la hemoglobina está glicosilado. GA y FRA son productos glicosilados de albúmina y proteína de suero, respectivamente, es decir, el grupo £-amino de un residuo de lisina de la albúmina o de la proteína de suero sanguíneo está glicosilado.

Un método enzimático se considera como un método sencillo, fácil y barato para analizar con precisión proteínas glicosiladas. Las solicitudes de Patente Japonesas abiertas a Inspección Pública Núm. 6-46846, Núm. 5-192193, Núm. 2-195900, y Núm. 2-195899, y las Solicitudes de Patente Internacional Núm. WO 98/48043, y WO 97/13872 se indican como ejemplos de documentos que dan a conocer el método enzimático.

Sin embargo, para proporcionar una composición para analizar con precisión proteínas glicosiladas, es esencial 1) evitar el efecto de los componentes de globulinas y el ácido ascórbico y 2) estabilizar las proteasas, como mínimo, la enzima que reacciona con los aminoácidos glicosilados. Además, en el caso en el que la proteína glicosilada es una albúmina glicosilada, es importante 3) analizar con precisión la albúmina y 4) evitar el efecto de la hemoglobina glicosilada.

1) Métodos convencionales para evitar el efecto de los componentes de globulinas y el ácido ascórbico

Se conoce que la cantidad de globulinas de un diabético cambia y afecta al valor de FRA [Rodrigues, S. y otros, Clin. Chem. 35: 134-138 (1989) ]. Se ha desarrollado un método para inhibir selectivamente la acción de una proteasa sobre los componentes de globulinas mediante la adición de un ión metálico específico y una proteína A o G a una solución de reacción de proteasas (Solicitud de Patente Japonesa Núm 11-231259) . Las proteínas glicosiladas pueden analizarse sin ser afectadas por los componentes de globulina utilizando el método de la presente invención. Como inhibidor de proteasas selectivo para globulinas utilizado en el método, se mencionan metales, proteína A, y proteína G. Entre los metales especificados en esta solicitud de patente, son metales altamente eficaces los metales pesados, que pueden tener problemas de seguridad ambiental. Los metales menos eficaces pueden hacer que la solución de reactivos en enturbie si se combinan con otros reactivos (o composiciones) . Además, la proteína A, y la proteína G son reactivos muy caros.

Como método para adsorber de forma selectiva globulina en sangre, es conocido un agente de tratamiento de la sangre que adsorbe endotoxinas y globulina en sangre utilizando el principio de la cromatografía y un copolímero de vinilo que introdujo un ligando que tiene un esqueleto de esteroide (Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 61-94663) . Sin embargo, los resultados mostrados en la Tabla 1 de los ejemplos de la Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 61-94663 indican que sólo se confirmó que fueron adsorbidas a1-globulina y a2-globulina, pero la y-globulina que representa el 70% o más de los componentes de globulina no fue adsorbida. Suponiendo que la gamma-globulina fuera adsorbida, no puede anticiparse la capacidad del agente de tratamiento de la sangre de inhibir la actividad de las proteasas sobre la y-globulina.

Las ocasiones en que se ingiere una gran cantidad de ácido ascórbico como suplemento han aumentando en los últimos años. Las muestras clínicas que contienen ácido ascórbico a elevada concentración también han aumentado. El ácido ascórbico induce una variedad de efectos sobre los exámenes clínicos debido a la fuerte acción de reducción.

Como método para obviar los efectos del ácido ascórbico, es conocido un método de eliminación de forma química o enzimática del ácido ascórbico en muestras, utilizando una oxidasa de ácido ascórbico. Cuando se analizan los aminoácidos glicosilados, producidos por la fragmentación de las proteínas glicosiladas con una proteasa utilizando una enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es preferente un método de previa eliminación de ácido ascórbico, utilizando una oxidasa de ácido ascórbico (ASOx) en el momento de la reacción con una proteasa, en vista de un pequeño efecto sobre el sistema de coloración.

Como ejemplo de eliminación de ácido ascórbico en muestras utilizando ASOx en presencia de una proteasa, se ha informado de un experimento en el que se hace reaccionar ASOx con una solución de muestra en una solución tampón de ácido 2-[4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil]etano sulfónico (HEPES) a pH 8, 0 (Clinical Chemistr y , 27: 99-106, 1998) . El informe describe que la capacidad de tratamiento del ácido ascórbico no cambió después de almacenamiento en frío durante dos semanas.

Sin embargo, la investigación realizada por los autores de la presente invención ha revelado que, cuando están presentes una solución tampón HEPES a pH 8, 0, una proteasa y ASOx, la capacidad de tratamiento del ácido ascórbico se pierde casi en su totalidad en un día cuando se almacena a 37ºC, o en dos semanas cuando se almacena a 10ºC.

2) Técnica anterior para la estabilización de proteasas y enzimas que reaccionan, como mínimo, con un aminoácido glicosilado

Una solución de proteasas a una concentración inconcebiblemente alta, de un nivel que no se conoce en otro sector, tal como la industria alimentaria, se utiliza en el ensayo clínico de proteínas glicosiladas. Se conoce que las proteasas se auto-digieren en una solución acuosa. Es difícil suponer que una proteasa se mantiene estable en una solución acuosa a una concentración tan elevada. Por lo tanto, las proteasas utilizadas para una composición para analizar proteínas glicosiladas han sido suministradas como un producto liofilizado.

No se ha conocido ninguna composición para analizar proteínas glicosiladas, ni un método de ensayo de proteínas glicosiladas, en los que se estabilice una proteasa en estado líquido y que sea almacenable durante un largo período de tiempo. Tampoco ha habido ninguna composición para analizar proteínas glicosiladas, ni un método de ensayo de proteínas glicosiladas, en los que la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, se estabilice en estado líquido y sea almacenable durante un largo período de tiempo.

3) Técnica anterior relacionada con un método para analizar albúmina con precisión

La inmunización con anticuerpos anti-albúmina y un método de tinción que utiliza verde de bromocresol (BCG) , púrpura de bromocresol (BCP) , o similares, se conocen como métodos para determinar la albúmina. El método de tinción es ampliamente utilizado en las inspecciones diarias debido a que es un procedimiento sencillo y de bajo coste. Aunque se ha confirmado el efecto del BCG sobre el componente de globulina, el BCG presenta la desventaja de una baja especificidad para la albúmina.

Por otro lado, el BCP es afectado fácilmente por sustancias que coexisten, a pesar de la alta especificidad para la albúmina. En particular, el BCP es afectado por compuestos SH, dando lugar a un problema de variación en los resultados del ensayo, según las condiciones de oxidación-reducción de la albúmina. Como un medio para resolver este problema, se ha propuesto un método en el que se hace reaccionar el BCP en presencia de un agente desnaturalizante de proteínas y/o un reactivo SH (Solicitud de Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Núm. 10-232233) . Sin embargo, no ha habido ejemplos en el estudio de la reactividad... [Seguir leyendo]

1. Método de ensayo de proteínas glicosiladas utilizando una proteasa y una enzima que reacciona, como mínimo,

con un aminoácido glicosilado, que comprende hacer reaccionar la muestra con la enzima que reacciona, como 5 mínimo, con un aminoácido glicosilado y, a continuación, con la proteasa, en el que se excluye

que se añade una fructosil-aminoácido-oxidasa a la muestra después de hacer reaccionar la muestra con la proteasa, en el caso que la enzima que reacciona, como mínimo, con un aminoácido glicosilado, es fructosilaminoácido-oxidasa.