Apoptosis inducida por el anticuerpo monoclonal anti-Her2.

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE ANTICUERPOS ANTI-HER2, QUE INDUCEN APOPTOSIS EN CELULAS QUE EXPRESAN HER2.

DICHOS ANTICUERPOS SE UTILIZAN PARA "MARCAR" TUMORES CON SUPEREXPRESION DE HER2, PARA SU ELIMINACION POR EL SISTEMA INMUNE DEL HUESPED. ASIMISMO, SE DESCRIBEN LINEAS CELULARES DE HIBRIDOMA QUE PRODUCEN DICHOS ANTICUERPOS, METODOS DE TRATAMIENTO DEL CANCER UTILIZANDO DICHOS ANTICUERPOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN.

Apoptosis inducida por el anticuerpo monoclonal anti-Her2.

Campo de la invención La presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo que induce apoptosis en células que expresan Her2.

Antecedentes de la invención El oncogén Her2 codifica para una glicoproteína asociada a membrana a la que se hace referencia como p185HER-2 que tiene actividad tirosina kinasa. Her2 es un miembro de la subfamilia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , que incluye el receptor EGF y los receptores Her3 y Her4 (Kraus y col., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 86, 9193-9197 (1989) ; Plowman y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90, 1746-1750 (1993) ) . La secuencia de Her2 fue descrita por Semba y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6497-6501 (1985) ) ; Coussens y col. (Science 230, 974976 (1985) ) . Schecter y col. describieron un gen de rata relacionado (Nature 312, 515-516 (1984) ) .

Se ha descrito una mayor expresión del oncogén Her2 en células y líneas celulares tumorales por parte de varios grupos (Coussens y col., antes citado; King y col., antes citado) . La mayor expresión de Her2 se produce como resultado de amplificación génica o de una mayor expresión del gen de copia única. Estas observaciones sugerían que Her2 puede ser sobreexpresado en tejido canceroso humano. Slamon y colaboradores (Slamon y col., Science 235, 177-182 (1987) ; Slamon y col., Science 244, 707-712 (1989) ) examinaron los niveles de expresión de Her2 en tumores tomados de una gran muestra de pacientes de cáncer de mama y de ovario. Se vio que casi un 30% de esas pacientes tenían amplificación y sobreexpresión del gen Her2, lo cual estaba asociado a un pobre desenlace clínico (aumento de las recidivas y baja razón de supervivencia) , particularmente en pacientes de cáncer de mama positivo en nódulos. Las correlaciones dadas por Slamon han sido confirmadas en una serie de estudios (véanse, por ejemplo, Ro y col., Cancer Res. 49, 6941-6944 (1989) ; Walker y col., J. Cancer 60, 426-429 (1989) ; Wright y col., Cancer Res. 49, 2087-2090 (1989) ; Berchuck y col., Cancer Res. 50, 4087-4091 (1990) ; Kallioniemi y col., Int. J. Cancer 49, 650-655 (1991) ; Rilke y col., Int. J. Cancer 49, 44-49 (1991) ) .

La presencia de ciertos factores, tales como la sobreexpresión de Her2, que son indicativos de un pobre pronóstico, puede sugerir que es apropiada la terapia adyuvante después de la extirpación quirúrgica. La terapia adyuvante puede incluir quimioterapia a altas dosis y trasplante autólogo de médula ósea. Se ha descrito recientemente (Muss y col., N. Engl. J. Med. 330, 1260-1266 (1994) ) que las pacientes de cáncer de mama que tienen tumores que exhiben sobreexpresión de Her2 disfrutaban de beneficios significativos gracias a la terapia adyuvante.

Por analogía con otras proteína tirosina kinasas de receptores, se supone que un ligando para Her2 estimula la fosforilación de los receptores. Se ha descrito que una serie de factores polipeptídicos aumentan la fosforilación de la tirosina de Her2 y se supuso que eran un ligando (Wen y col., Cell 64, 559-572 (1992) ; Holmes y col., Science 256, 1205-1210; Marchionni y col., Nature 362, 312-318 (1993) ; Falls y col., Cell 72, 801-815 (1993) ) . Sin embargo, no existe evidencia de que ninguno de estos factores sea un ligando verdadero que se une directamente a Her2 y estimula la fosforilación de los receptores. Una aproximación para salvar la presencia de ligando es generar un anticuerpo monoclonal (“mAb”) de tipo ligando. Varios grupos han generado mAbs anti-Her2 usando un receptor

Her2 de la superficie celular o un dominio extracelular purificado del receptor Her2 (Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2569-2573 (1990) ; Hanwerth y col., Br. J. Cancer 68, 1140-1145 (1993) ; Srinivas y col., Cancer Immunol. Immunother. 36, 397-402 (1993) ; Stancovaski y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8691-8695 (1991) ) . Estos mAbs estimulaban la fosforilación de la tirosina de Her2 de células con sobreexpresión, pero no fueron totalmente caracterizados en términos de unión a, y fosforilación de, cada uno de Her2, Her3 ó Her4 o en términos de la activación de la kinasa en células transfectadas con Her2.

Se han descrito con anterioridad los efectos inhibitorios del crecimiento de mAbs anti-Her2 sobre células de cáncer de mama (Tagliabue y col., Int. J. Cancer 47, 933-937 (1991) ; Hudziak y col., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172 (1989) ; Drevin y col., Oncogen 2, 387-394 (1988) ; Fendly y col., Cancer Res. 50, 1550-1558 (1990) , Hanwerth y col., antes 55 citado; véase también la revisión de Vitetta y Uhr, Cancer Res. 54, 5301-5309 (1994) ) , pero estos efectos fueron interpretados como citostáticos, ya que la eliminación del anticuerpo permitía reanudar el crecimiento celular. Xu y col. (Int. J. Cancer 53, 401-408 (1993) ) describieron anticuerpos anti-Her2 que eran citotóxicos para el crecimiento de células tumorales independientes de anclaje.

Se describió un mAb anti-receptor de EGF que inducía la apoptosis en la línea celular de carcinoma colorrectal humano, DiFi, que sobreexpresa el receptor de EGF, y que inducía cambios morfológicos a concentraciones de 5 a 20 nM. Estos efectos fueron interpretados en términos de bloqueo de la unión del EGF al receptor afín por el mAb competitivo y de falta de la actividad mitogénica del mAb (Wu y col., J. Clin. Invest. 95, 1897-1905 (1995) ) .

La apoptosis, o muerte celular programada, es una forma de muerte celular caracterizada por encogimiento de la célula y fragmentación del ADN. El colapso del núcleo celular es aparente, ya que la cromatina se fragmenta en unidades mononucleosómicas simples o múltiples, un proceso mediado por una endonucleasa endógena. La apoptosis es distinta de la muerte celular necrótica, que da lugar a hinchamiento celular y liberación de los componentes intracelulares (Kerr y col., Br. J. Cancer 26, 239-257 (1972) ; Wyllie y col., Int. Rev. Cytol. 68, 251-306 (1980) ; Wyllie, Nature 284, 555-556 (1980) ) . Las células apoptóticas, sin liberar dichos componentes, son fagocitadas y por tanto degradadas (Savill y col., Nature 343, 170-173 (1990) ) . Por lo tanto, la apoptosis da lugar a un proceso eficiente para la eliminación de células no viables por los propios mecanismos de defensa del huésped.

Deshane, J. y col. (“Intracellular antibody knockout of the erbB2 oncoprotein achieves targeted eradication of tumor targets by induction of apoptosis”, J. Invest. Med., Vol. 32, Nº Supl. 2, Abril de 1995, página 328A) se refieren a la supresión por anticuerpos intracelulares de la oncoproteína erbB-2 y a la erradicación dirigida de blancos tumorales por inducción de apoptosis en este proceso. Deshane, J. y col. usan construcciones génicas diseñadas para codificar inmunoglobulinas de cadena sencilla (sFvs) con especificidad anti-ErbB-2 para la expresión intracelular de un anticuerpo anti-erbB-2.

Grim, J. y col. (“Induction of apoptotic cell death in erbB-2 overexpressing tumor cells of diverse histologic subtypes mediated by intracellular localization of an anti-erbB-2 sFv”, Cancer Gene Therapy, Vol. 1, Nº 4, Diciembre de 1994, páginas 333-334) se refieren a la inducción de muerte celular apoptótica en células tumorales que sobreexpresan erbB-2 de diversos subtipos histológicos mediada por la localización intracelular de un SSV anti-erbB-2. La construcción génica de Grim, J. y col. es administrada a la línea celular de carcinoma de ovario humana SKOV3 por el método del adenovirus-polilisina (“AdpL) y la expresión intracelular de un anticuerpo de cadena sencilla anti-erbB2 conduce a una regulación decreciente de la expresión de erbB-2 de la superficie celular y a la inducción de apoptosis en las células tumorales.

Curiel, O. (“Strategies to accomplish targeted tumor cell cytotoxicity”, Gene Therapy, Vol. 2, Nº Supl. 1, Noviembre de 1995, página 520) se refiere a estrategias para conseguir la citotoxicidad de las células tumorales pretendidas. Curiel, O. Describe la expresión intracelular de un anticuerpo de cadena sencilla (sFv) anti-erbB-2 sFvs y la inducción de apoptosis.

WO 94/00136 A (6 de Enero de 1994) se relaciona con el uso de una combinación de anticuerpos monoclonales anti-erbB-2 para la prevención y el tratamiento de malignidades humanas por inducción de apoptosis.

Kita, Y. y col. (“ErbB receptor activation, cell morphology changes and apoptosis induced by anti-Her2 monoclonal antibodies”, Bioch. Biophys. Res. Comm., Vol. 226, Nº 1, 4 de Septiembre de 1996, páginas 59-69) se refieren a la activación de receptores erbB, a cambios en la morfología celular y a la apoptosis... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Her2 o fragmento del mismo que induce apoptosis en células que expresan Her2 en una cantidad suficiente para inducir apoptosis, en una mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de la Reivindicación 1, donde el anticuerpo reconoce un epítopo sobre un polipéptido Her2 que es reconocido por el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº HB-12078.

3. Una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal anti-Her2 que induce apoptosis en células que expresan Her2

4. La composición farmacéutica de la Reivindicación 1, donde fragmento es un fragmento F (ab) o Fab’.

5. Un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº HB-12078.

6. Línea celular de hibridoma ATCC Nº HB-12078.

7. La composición farmacéutica de la Reivindicación 1, donde las células que expresan Her2 son células tumorales.

8. La composición farmacéutica de la Reivindicación 7, donde las células tumorales derivan de cánceres de pulmón, ovario, próstata, gástrico y colorrectal.

9. Uso de la composición farmacéutica de la Reivindicación 1 para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer.

10. Uso según la Reivindicación 92, donde el medicamento induce apoptosis.

11. La composición de la Reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

12. La composición de la Reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

13. La composición de la Reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.