Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos.

Un anticuerpo aislado que comprende un primer y un segundo polipéptidos de cadena pesada,

cuatro polipéptidos de cadena ligera y cuatro sitios de unión antigénica, en el que dicho primer y segundo polipéptidos de cadena pesada comprenden

VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,

en donde VD1 es un primer domino variable de cadena pesada (VH), VD2 es un segundo dominio VH, Fc es una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es 0 o 1, y cada uno de los cuatro polipéptidos de cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera (VL), en el que cada uno de dichos sitios de unión antigénica está formado por un dominio VH del primer o del segundo polipéptido de cadena pesada y un dominio VL de los cuatro polipéptidos de cadena ligera.

Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos modificados por ingeniería genética, con cuatro sitios de uniones antigénicas funcionales, y a usos, tales como usos terapéuticos, para dichos anticuerpos modificados por ingeniería genética.

Descripción de la técnica relacionada Estructura de los anticuerpos de origen natural

Los anticuerpos de origen natural (inmunoglobulinas) comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, estando una cadena ligera unida a cada una de las cadenas pesadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (VH) seguido de diversos dominios constantes (tres o cuatro dominios constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4, dependiendo de la clase de anticuerpo). Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante (CL) en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Véase la Fig. 1 del presente documento. Se piensa que los restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada, véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651-663 (1985); y Novotny y Haber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 4592-4596 (1985).

Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión del anticuerpo con un antígeno, pero están implicados en diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada están directamente implicados en la unión del anticuerpo con el antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada de origen natural tienen la misma estructura general, comprendiendo cada uno de ellos cuatro regiones marco conservadas (FR, framework regions), cuyas secuencias están algo conservadas, conectados por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD,

(1991)). Las cuatro FR adoptan en gran medida una conformación de lámina beta y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se sujetan en estrecha proximidad gracias a las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión antigénica.

Las Figuras 2A-E del presente documento representan las estructuras de los cinco isotipos de inmunoglobulinas principales de origen natural. Las inmunoglobulinas IgG, IgD e IgE poseen solamente dos sitios de unión antigénica. Por otro lado, la IgA y la IgM son capaces de formar estructuras poliméricas con valencias superiores.

Las células plasmáticas secretan IgM como un pentámero en el que cinco unidades monoméricas se sujetan entre sí mediante enlaces disulfuro que unen sus dominios carboxilo terminal (Cp4/Cp4) y dominios Cp3/Cp3. Las cinco subunidades monoméricas se disponen con tres regiones Fe en el centro del pentámero y los 1 sitios de unión antigénica en la periferia de la molécula. Cada pentámero contiene un polipéptido ligado a Fe adicional denominado cadena (de unión) J, que está unida por puentes disulfuro al resto de cisteína carboxilo terminal de dos de las cadenas de 1 p. La cadena J parece que es necesaria para la polimerización de los monómeros para formar la IgM pentamérica, esta se añade justo antes de la secreción del pentámero. Una molécula de IgM puede unir 1 moléculas de hapteno pequeñas; sin embargo, debido al impedimento estérico, solamente 5 moléculas de antígenos más grandes pueden unirse simultáneamente. El aumento de la valencia de la IgM pentamérica aumenta su capacidad para unir dichos antígenos multidimensionales como partículas virales y glóbulos rojos (RBC, Recf Blood Cells).

La IgA existe principalmente como un monómero, aunque algunas veces se observan formas poliméricas, tales como dímeros, trímeros e incluso tetrámeros. La IgA de secreciones externas consta de un dímero o tetrámero, de un polipéptido de cadena J, y de una cadena polipeptídica denominada componente secretor.

Anticuerpos para usos clínicos

Se ha dado un amplio uso a los anticuerpos monoclonales, particularmente a los derivados de roedores, incluyendo ratones, sin embargo, son frecuentemente antigénicos en el uso clínico humano. Por ejemplo, una limitación principal en el uso clínico de anticuerpos monoclonales de roedores es una respuesta antiglobulina durante la terapia (Miller et al., Blood 62: 988-995 (1983); y Schroff, R. W. etal., Cáncer Res. 45: 879-885 (1985)).

La técnica ha intentado superar este problema construyendo anticuerpos "quiméricos" en los que un dominio variable de unión antigénica animal está acoplado a un dominio constante humano (Cabilly et al., la patente de Estados Unidos N2 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); y Neuberger et al., Nature 314: 268-27 (1985)). El ¡sotipo del dominio constante humano puede seleccionarse para adaptar el anticuerpo quimérico para la participación en la CCDA y en la CDC (véase, por ejemplo, Brüggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Love et al., Methods in Enzymology 178: 515-527 (1989); y Bindon ef ai, J. Exp. Med. 168: 127-142 (1988)). En la realización típica, dichos anticuerpos quiméricos contienen aproximadamente un tercio de las secuencias de roedores (o de otras especies no humanas) y por tanto son capaces de suscitar una respuesta anti-globulina significativa en seres humanos. Por ejemplo, en el caso del anticuerpo anti-CD3 murino, OKT3, gran parte de la respuesta anti-globulina resultante se dirige contra la región variable en lugar de contra la región constante (Jaffers et al., Transplantation 41: 572-578 (1986)).

En un esfuerzo adicional para resolver las funciones de unión antigénica de los anticuerpos y para minimizar el uso de secuencias heterólogas en anticuerpos humanos, Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); y Verhoeyen et ai, Science 239: 1534-1536 (1988)) han sustituido las CDR o las secuencias de las CDR de roedores por los segmentos correspondientes de un anticuerpo humano.

La promesa terapéutica de esta estrategia se basa en la eficacia clínica de un anticuerpo humanizado específico para el antígeno CAMPATH-1 con dos pacientes de linfoma no Hodgkin, uno de los cuales había desarrollado previamente una respuesta anti globulina contra el anticuerpo de rata parental (Riechmann et al., Nature 332: 323- 327 (1988); y Hale et al., Lancet i: 1394-1399 (1988)).

En algunos casos, la sustitución de las CDR de anticuerpos de roedores por las CDR humanas en regiones marco conservadas humanas es suficiente para transferir una alta afinidad de unión antigénica (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), mientras que en otros casos ha sido necesario reemplazar adicionalmente uno (Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988)) o vahos (Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 129-133 (1989)) restos marco conservados. Véase también Co et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873 (1991); la Patente de Estados Unidos N2 5.821.337 (Cárter et al.); y la Patente de Estados Unidos N2 5.53.11 (Queen et al.). Otras referencias relacionadas con la humanización de anticuerpos incluyen Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185 (1991); Daugherty et al., Nucleic Acids Research 19(9): 2471-2476 (1991); Brown et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2663-2667 (1991); y Junghans et al., Cáncer Research 5: 1495-152 (199).

En lugar de con un anticuerpo quimérico/humanizado, a un paciente se le puede tratar con un anticuerpo humano para impedir que se susciten anticuerpos humanos contra un anticuerpo murino (lo que se conoce como "respuesta HAMA"). Se dispone de diversas tecnologías para generar anticuerpos humanos.

Los anticuerpos humanos pueden seleccionarse usando tecnología de presentación de fagos. La presentación de fagos se ha adaptado para seleccionar anticuerpos humanos de un donante inmunizado (Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). De acuerdo con esta estrategia, se usa la PCR para amplificar genes de dominio variable a partir de ARNm preparado de linfocitos de... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que comprende un primer y un segundo polipéptidos de cadena pesada, cuatro polipéptidos de cadena ligera y cuatro sitios de unión antigénica, en el que dicho primer y segundo polipéptidos de cadena pesada comprenden

VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,

en donde VD1 es un primer domino variable de cadena pesada (VH), VD2 es un segundo dominio VH, Fe es una región Fe, X1 y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es o 1,

y cada uno de los cuatro polipéptidos de cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera (VL), en el que cada uno de dichos sitios de unión antigénica está formado por un dominio VH del primer o del segundo polipéptido de cadena pesada y un dominio VL de los cuatro polipéptidos de cadena ligera.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc del primer polipéptido de cadena pesada y del segundo polipéptido de cadena pesada comprende: (a) VH-CHI-enlazador flexible-VH-CH1-Fc; o (b) VH-CH1- VH-CH1-Fc, en donde CH1 es un dominio constante de cadena pesada.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que VD1-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc de cada uno del primer polipéptido de cadena pesada y del segundo polipéptido de cadena pesada comprende VH-CH1-enlazadorflexible-VH-CH1-Fc.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc de cada uno del primer polipéptido de cadena pesada y del segundo polipéptido de cadena pesada comprende VH-CH1-VH-CH1-Fc, en donde CH1 es un dominio constante de cadena pesada.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el enlazador flexible comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en gly-ser, gly-ser-gly-ser (SEC ID N2: 1), ala-ser y gly-gly-gly-ser

(SEC ID N2: 11).

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo no comprende una secuencia nativa de un anticuerpo de IgM o IgA.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que los cuatro polipéptidos de cadena ligera comprenden adicionalmente un dominio constante de cadena ligera (dominio CL).

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho anticuerpo es internalizado más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que los cuatro sitios de unión antigénica se unen al mismo antígeno.

1. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que los cuatro sitios de unión antigénica se unen a dos o más antígenos diferentes.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-1, en donde dicho anticuerpo se une a una proteína de superficie celular expresada o sobreexpresada por células tumorales.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que la proteína de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR), el receptor HER2, el receptor HER3, el receptor HER4 y el receptor DcR3.

13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1, en donde dicho anticuerpo se une al receptor ErbB.

14. El anticuerpo de la reivindicación 12, en el que la proteína de superficie celular es el receptor HER2.

15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1, en donde dicho anticuerpo se une a un receptor de la superfamilia de Receptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNF).

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en el que el receptor de TNF es un receptor Apo2L.

17. El anticuerpo de la reivindicación 16, en el que el receptor Apo2L se selecciona del grupo que consiste en DR4, DR5, DcR1 y DcR2.

18. El anticuerpo de la reivindicación 17, en el que el receptor Apo2L es DR4 o DR5.

19. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo agonista.

2. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, en donde dicho anticuerpo induce la apoptosis.

21. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1, en donde dicho anticuerpo se une a un antígeno de superficie de células B.

22. El anticuerpo de la reivindicación 21, en el que el antígeno de superficie de células B se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD2, CD22 y CD4.

23. El anticuerpo de la reivindicación 22, en el que el antígeno de superficie de células B es CD2.

24. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 conjugado con un agente citotóxico.

25. El inmunoconjugado de la reivindicación 24, en el que el agente citotóxico es activo destruyendo células una vez internalizado.

26. El inmunoconjugado de la reivindicación 24, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radiactivo, un maitansinoide y una caliqueamicina.

27. Un ácido nucleico aislado que codifica dicho primer polipéptido de cadena pesada, dicho segundo polipéptido de cadena pesada y dichos cuatro o más polipéptidos de cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

28. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 27.

29. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 28.

3. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 29 de modo que se exprese el ácido nucleico.

31. El proceso de la reivindicación 3 que adicionalmente comprende recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula hospedadora.

32. El proceso de la reivindicación 31 en el que el anticuerpo se recupera del medio de cultivo de la célula hospedadora.

33. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un mamífero.

34. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el trastorno es cáncer.

35. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 33 o 34, en donde el método comprende adicionalmente administrar un agente citotóxico al mamífero.

36. Un método para inducir la apoptosis de una célula cancerosa que comprende exponer in vitro una célula al anticuerpo de la reivindicación 2.

37. Un método para destruir una célula B que comprende exponer in vitro una célula B al anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 21-23.

38. Un método para destruir una célula que expresa un receptor ErbB que comprende exponer in vitro una célula que expresa un receptor ErbB al anticuerpo de la reivindicación 13.

39. El método de la reivindicación 38, en el que la célula es una célula cancerosa que sobreexpresa dicho receptor ErbB.