Anticuerpos de un solo dominio estabilizados.

Constructo polipeptídico que comprende:

- al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra una diana terapéutica y/o de diagnóstico,

y

- al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra albúmina sérica humana, que es

a) SEQ ID NO: 1, o

b) un anticuerpo VHH de Camelidae humanizado que es una secuencia homóloga que presenta una identidad de secuencia de más del 90% con una secuencia representada por SEQ ID NO: 1, y que da reacción cruzada entre albúmina sérica de cerdo, humana, de ratón, de hámster y de conejo.

Anticuerpos de un solo dominio estabilizados Campo de la invención La presente invención proporciona constructos polipeptídicos heteroespecíficos que comprenden uno o más anticuerpos de un solo dominio tal como se definen en las reivindicaciones, teniendo dichos constructos estabilidad in vivo mejorada, y su uso en diagnóstico y terapia.

Antecedentes de la invención Los agentes terapéuticos polipeptídicos y en particular los agentes terapéuticos basados en anticuerpos tienen un potencial significativo como fármacos puesto que tienen una especificidad exquisita para su diana y una baja toxicidad inherente. Sin embargo, para ser eficaces como agente terapéutico, debe optimizarse su perfil farmacocinético. La mayoría de las aplicaciones de anticuerpos actuales son para trastornos agudos. Sin embargo, existen oportunidades significativas para desarrollar agentes terapéuticos de anticuerpos para estados crónicos. Esto requerirá grandes dosis de proteína a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Puesto que el coste de la producción de anticuerpos en células de mamíferos es alto, se ha desistido del desarrollo de agentes terapéuticos de anticuerpos tradicionales para estas aplicaciones. Un enfoque alternativo ha sido expresar fragmentos de anticuerpos tales como Fab o Fv de cadena sencilla en sistemas de expresión microbianos tales como de levaduras y bacterias. Sin embargo, estos fragmentos tienen tiempos de circulación muy cortos in vivo.

Algunos de los enfoques iniciales para aumentar la circulación en el torrente sanguíneo de proteínas y péptidos se basaron en modificación química, tal como pegilación (documento US 4.179.337) . Ejemplos de tales productos son PEG-intron, es decir, interferón alfa-2b pegilado para el tratamiento de VHC, y el tratamiento de un trastorno crónico con anticuerpos modificados con PEG (A.P Chapman, Adv. Drug Deliver y Reviews (2002) , 54, 531-545) . Sin embargo, tales métodos químicos presentan varias desventajas, tales como inactivación de la proteína o el péptido diana debido a la modificación química de determinadas cadenas laterales de aminoácidos, inestabilidad de la proteína/del péptido diana durante la reacción química.

Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques alternativos, en primer lugar usando proteínas no convencionales o modificaciones, en segundo lugar usando métodos alternativos para aumentar la semivida in vivo. Por tanto, puede llevarse a cabo la estabilización del fármaco proteico eligiendo un andamiaje proteico inherentemente estable y proporcionando métodos para unir tal andamiaje a proteínas plasmáticas que aparecen a altas concentraciones, tales como inmunoglobulinas o albúmina. La unión a una proteína plasmática puede ser un medio eficaz para mejorar las propiedades farmacocinéticas de moléculas en general. De manera más precisa, se ha descrito la unión a albúmina para mejorar la semivida de proteínas: M.S. Dennis et al. (J. Biol. Chem. 33, 238390, 2002) aislaron péptidos que tenían afinidad por albúmina sérica. Cuando se unen a una molécula de Fab, se obtuvieron semividas comparables a Fab pegilados. Se han dado a conocer ligandos peptídicos que tienen afinidad por IgG o albúmina sérica (documento WO 01/45746) . Cemu Bioteknik (Nygren, Wigzell, Uhlen, documentos EP 486525 B1; US 6.267.964) descubrieron fusiones de proteínas o péptidos activos frente a polipéptidos de origen bacteriano que se unen a albúmina sérica (por ejemplo, estaf. A) . El inconveniente de estos enfoques basados en péptidos es que los péptidos tienen que plegarse de manera apropiada y ser accesibles para la unión a albúmina sérica cuando se fusionan a la proteína terapéutica. Por tanto, estos péptidos son inherentemente inestables y tienen afinidades en el rango submicromolar en vez del rango subnanomolar o nanomolar bajo, como es el caso con anticuerpos convencionales. Como parte de una proteína más grande, tal como una molécula de anticuerpo convencional, la unión de estos péptidos a albúmina puede estar impedida estéricamente.

Una molécula híbrida alternativa con dos unidades funcionales se basa en un anticuerpo heteroespecífico. Un híbrido de este tipo consistirá en un constructo de anticuerpo bifuncional o heteroespecífico con una entidad que tiene especificidad y afinidad por la diana, teniendo la segunda entidad especificidad y afinidad por una proteína sérica, tal como albúmina. Sin embargo, tales constructos heteroespecíficos basados en anticuerpos o fragmentos Fab convencionales tienen varios inconvenientes importantes: son grandes moléculas complejas compuestas por dos cadenas polipeptídicas (VH y VL) y por tanto son difíciles y caros de producir en grandes cantidades en sistemas de expresión de mamíferos. Además, producir anticuerpos bifuncionales compuestos por 4 cadenas (2 VH y 2 VL) tiene el riesgo inherente de dar como resultado moléculas con las combinaciones VH-VL improductivas y la consiguiente pérdida de actividad. Se han intentado varias alternativas con resultados dispares basándose en derivados peptídicos de anticuerpos convencionales, tales como diacuerpos y scFv bifuncionales (documentos WO0220615; WO9413804; WO9119739; W09409131) . Holliger et al (Nature Biotech. 15, 632-636, 1979) sugieren que la unión de uno de los de fragmentos de anticuerpo de un diacuerpo (constructo biespecífico derivado de un anticuerpo convencional) a inmunoglobulina sérica (IgG) puede prolongar el tiempo de permanencia en suero de tales diacuerpos pero no se realiza ninguna sugerencia de que puedan estabilizarse diacuerpos biespecíficos usando anticuerpos contra una proteína sérica distinta de la IgG sérica. Se sabe que los diacuerpos son inherentemente difíciles de producir debido a la pegajosidad de su superficie expuesta y debido a asociaciones no productivas entre las cuatro regiones V diferentes (2 VH + 2 VL) .

La unión covalente a proteínas séricas tal como se da a conocer, por ejemplo, en los documentos EP0793506B1, US 5.612.034, 6.103.233 y US20020003441, usando grupos reactivos que forman enlaces covalentes estables a una proteína sérica o a una célula, tienen la desventaja inherente de la modificación no deseada de la diana a través de los grupos reactivos.

Se han descrito fusiones a grandes proteínas de larga vida tales como albúmina (Syed et al, Blood 89, 3243-3252 (1997) , Yen et al, PNAS 89, 1904-1908 (1992) ; Celltech (documento WO0027435) ) o fusiones N-terminales de polipéptidos de albúmina (Delta Biotech/HGS, documentos US 5.380.712, US 5.766.883) o la parte Fc de IgG (Capon et al, Nature 337, 59-5-531 (1989) ; Ashkenazi et al, Curr. Op. Immunol. 9, 195-200 (1997) ) . Tales fusiones tienen la desventaja de una producción ineficaz y de producir reacciones inmunológicas no deseadas.

Muyldermans, Rev. Mol. Biotechnol., 2001, 74, 277-302 describe constructos de unión a antígeno bivalentes y biespecíficos paramados a partir de dominios VHH.

Smith et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12 750-756 describen F (ab’) 2 biespecíficos con especificidad por albúmina sérica de rata que tiene un mayor área bajo la curva en comparación con un F (ab’) 2 sin especificidad frente a albúmina.

El documento EP 0 368 684 A1 describe que un segundo sitio de unión para un componente sérico prolongaría la función efectora de un ligando de un solo dominio.

En el documento US 5.055.289 se ha descrito un complejo de interferón con un anticuerpo monoclonal para aumentar la semivida sérica de interferón. Tal enfoque tiene el riesgo inherente de afectar la actividad biológica del interferón puesto que el tamaño del constructo plantea el problema del impedimento estérico.

Los objetivos de la presente invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar constructos polipeptídicos de anticuerpos heteroespecíficos terapéuticos que superen los problemas de los anticuerpos terapéuticos de la técnica, concretamente, baja semivida in vivo, mal plegamiento, baja expresión y escasa estabilidad. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar métodos para proporcionar dichos anticuerpos heteroespecíficos.

Sumario de la invención Una realización de la presente invención es un constructo polipeptídico que comprende:

-al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra una diana terapéutica y/o de diagnóstico, y

-al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra una proteína sérica, tal como se define en las reivindicaciones.

Específicamente, la invención se refiere a un constructo polipeptídico que comprende:

-al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra una diana terapéutica y/o de diagnóstico, y

-al menos un anticuerpo de un... [Seguir leyendo]

1. Constructo polipeptídico que comprende:

-al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra una diana terapéutica y/o de diagnóstico, y

-al menos un anticuerpo de un solo dominio dirigido contra albúmina sérica humana, que es

a) SEQ ID NO: 1, o b) un anticuerpo VHH de Camelidae humanizado que es una secuencia homóloga que presenta una identidad de secuencia de más del 90% con una secuencia representada por SEQ ID NO: 1, y que da reacción cruzada entre albúmina sérica de cerdo, humana, de ratón, de hámster y de conejo.

2. Constructo polipeptídico según la reivindicación 1, en el que: -el número de anticuerpos de un solo dominio anti-diana es de al menos dos, y -al menos dos anticuerpos de un solo dominio anti-diana no comparten la misma secuencia, o todos los anticuerpos de un solo dominio anti-diana comparten la misma secuencia.

3. Constructo polipeptídico según la reivindicación 1 ó 2, en el que el al menos un anticuerpo de un solo dominio que es un anticuerpo VHH de Camelidae humanizado y que es una secuencia homóloga que presenta una identidad de secuencia de más del 90% con una secuencia representada por SEQ ID NO: 1

puede unirse a su diana con una afinidad mejor que 10-6 M.

4. Constructo polipeptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una diana es TNF-alfa.

5. Constructo polipeptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una diana es vWF. 30

6. Ácido nucleico que codifica para un constructo polipeptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.