Reactivos y procedimientos para terapias del músculo liso.

Polipéptido que consiste en una secuencia según la fórmula general I:

X2-[ X3-A(X4)APLP-X5-]U -X6en la que

X2 está ausente o comprende un dominio de transducción;

X3 es 0, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de la secuencia WLRR (SEC. ID. nº: 1);

X4 se selecciona de entre el grupo constituido por S, T, Y, D, E, fosfoserina y fosfotirosina;

X5 es 0, 1, 2 o 3 aminoácidos de una secuencia del género Z1-Z2-Z3,

en la que Z1 se selecciona de entre el grupo constituido por G y D;

Z2 se selecciona de entre el grupo constituido por L y K; y

Z3 se selecciona de entre el grupo constituido por S y T; y

X6 está ausente o comprende un dominio de transducción; y

en la que u es 1-5, y

en la que por lo menos uno de entre X2 y X6 comprende un dominio de transducción.

Reactivos y procedimientos para terapias del músculo liso

Referencia cruzada Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos nº de serie 60/314.535 presentada el 23 de agosto de 2001.

Declaración de financiación del gobierno El Gobierno de los Estados Unidos a través del Instituto Nacional de Salud, proporcionó ayuda financiera para este proyecto con la subvención nº RO1 HL58027-06. Por lo tanto, el Gobierno de los Estados Unidos puede poseer ciertos derechos sobre la presente invención.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a los campos de la biología celular, biología molecular, productos farmacéuticos, y la biología del músculo liso.

Antecedentes Existen tres tipos de músculos: cardíaco, esquelético y liso. Los músculos lisos se encuentran en las paredes de los vasos sanguíneos, vías respiratorias, tubo digestivo y aparato genitourinario. El calibre de los tubos revestidos por estos músculos depende de un equilibrio dinámico entre el estado de contracción y el estado de relajación de los músculos en estos órganos. En la contracción y relajación de los músculos lisos intervienen como mediadores diferentes vías de señalización dentro de los músculos.

Brophy y colaboradores publicaron en el Journal of Vascular Surger y vol. 29 nº 2, febrero de 1999, págs. 326-333 que la activación de la vía AMPc/PKA conduce a un aumento en la fosforilación de HSP20.

El trabajo de Arthur Beall et al. dan a conocer en el Journal of Biochemical Chemistr y vol. 274, nº 16, 16 de abril de 1999, páginas 11344-11351 que HPS20 está fosforilada en serina-16 durante la relajación dependiente de nucleótidos cíclicos.

Brophy et al. en Biology of Reproduction, vol. 57 nº 6, diciembre de 1997, págs. 1354-1359, informa que el músculo liso de las arterias umbilicales es únicamente resistente a la relajación en el tratamiento con un activador de adenilato ciclasa.

En el Journal of Biological Chemistr y , vol. 272, nº 1, págs. 11283-11287, Arthur Beall y colaboradores publicaron una corta secuencia de péptidos de una proteína citosólica de 20 kDa que se fosforila tras la activación de la vía de señalización del AMPc. La secuencia peptídica identificada corresponde a la pequeña proteína del choque térmico HSP20.

Las vías que provocan la relajación también inhiben la contracción. La contracción mantenida del músculo es un "espasmo" del músculo. Este espasmo se puede evitar activando las vías o sistemas que provocan la relajación, o en otras palabras, inhiben la contracción.

En su mayor parte, los músculos lisos son únicos, ya que carecen de la estructura ordenada de los músculos cardíacos y esqueléticos y porque son capaces de mantener contracciones tónicas con un uso mínimo de oxígeno. La contracción tónica patológica es un estado en el que los músculos se encuentran en espasmo.

Muchas enfermedades están asociadas al espasmo del músculo liso vascular ("vasoespasmo") , músculo liso que recubre los vasos sanguíneos. El vasoespasmo, del vaso sanguíneo produce el estrechamiento de la luz del vaso, lo que limita la circulación sanguínea. El espasmo de cualquier vaso sanguíneo lleva a la isquemia del órgano al que suministra sangre el vaso sanguíneo. La isquemia es la falta reversible de circulación sanguínea y de suministro de oxígeno a los tejidos. En caso de espasmo de los vasos en el corazón ello conduce a la isquemia cardíaca y/o infarto; el espasmo de los vasos en el cerebro conduce al accidente cerebrovascular; el espasmo de los vasos que irrigan el intestino conduce a la isquemia mesentérica, una falta de relajación de los vasos en el pene conduce a la impotencia, ya que la erección requiere la vasodilatación de los vasos sanguíneos de los cuerpos cavernosos (pene) ; y el espasmo de los vasos sanguíneos intracraneales conduce a las jaquecas.

La vasoconstricción excesiva (o vasodilatación inadecuada) ocurre también en otras enfermedades. La hipertensión (presión arterial alta) es causada por vasoconstricción excesiva, así como engrosamiento, de la pared del vaso, en particular en los vasos más pequeños de la circulación. Este proceso puede afectar también a los vasos de los pulmones, y producir hipertensión pulmonar (pulmón) y asma (broncoespasmo) .Otros trastornos conocidos por estar asociados a excesiva constricción, o a la inadecuada dilatación de los músculos lisos incluyen la toxemia del embarazo, el parto prematuro, la preeclampsia/eclampsia, la enfermedad o fenómeno de Raynaud, la fisura anal, la acalasia, la uremia hemolítica y la angina de Prinzmetal, una forma de espasmo coronario que produce la angina de pecho. El espasmo en las arterias coronarias también se produce durante la manipulación mecánica de las arterias coronarias, tales como durante la angioplastia y la colocación de la endoprótesis vascular. Este espasmo puede conducir a isquemia e infarto.

Las intervenciones quirúrgicas que involucran los vasos sanguíneos también se complican por vasoespasmo de los músculos lisos, lo que puede dar lugar a complicaciones tanto a corto plazo como a largo plazo incluyendo la 10 restenosis y la oclusión vascular. Hay un patrón general en el que el vasoespasmo, si se mantiene, conduce a la remodelación constrictiva/hiperplasia de la íntima, y en última instancia a la oclusión vascular. Las intervenciones quirúrgicas correctivas, como la colocación de endoprótesis vasculares en un vaso sanguíneo, la angioplastia, y la implantación de dispositivos protésicos tales como fístulas y derivaciones para acceso a diálisis, están acompañados de daño al músculo liso. Esto conduce a la proliferación y migración de células del músculo liso. En última instancia esto conduce a la remodelación constrictiva y a la hiperplasia de la íntima. Este proceso conduce a la restenosis, al fallo del injerto protésico, al fallo de la endoprótesis y del injerto de endoprótesis vascular, al fallo del implante microvascular, a aterosclerosis y a vasculopatía del trasplante.

Aunque no completamente comprendida, hiperplasia de la íntima actúa como mediadora de una secuencia de fenómenos que incluyen la lesión de células endoteliales y la proliferación del músculo liso vascular y migración de los medios a la íntima. Esto está asociado a una modulación fenotípica de las células del músculo liso de un fenotipo contráctil a uno sintético.

Las células del músculo liso "sintéticas" segregan proteínas de la matriz extracelular, lo que conduce a la oclusión vascular patológica, como se describió anteriormente. Por otra parte, el aumento de la proliferación y migración de células del músculo liso también puede dar lugar a tumores de células de músculo liso, tales como leiomiosarcomas y leiomiomas.

Por lo tanto, sería de gran utilidad para identificar nuevos procedimientos y productos terapéuticos para tratar o inhibir el vasoespasmo del músculo liso, estimular la relajación de los músculos lisos, mejorar otras terapias que involucran a los músculos lisos, y para tratar e inhibir la proliferación y la migración de células del músculo liso.

Sumario de la invención La presente invención proporciona nuevos procedimientos y terapias para tratar o inhibir el vasoespasmo del músculo liso, estimular la relajación del músculo liso, mejorar otras terapias que involucran el músculo liso, y para tratar e inhibir la proliferación y migración de células del músculo liso.

En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos 40 según la fórmula general I:

X1-X2-[X3-A (X4) APLP-X5-]U -X6

en la que X1 está ausente;

X2 está ausente o comprende un dominio de transducción;

X3 es 0, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de la secuencia WLRR (SEC. ID. nº: 1) ;

X4 se selecciona de entre el grupo constituido por S, T, Y, D, E, análogos de fosfoserina y análogos de fosfotirosina;

X5 es 0, 1, 2 o 3 aminoácidos de una secuencia del género Z1-Z2-Z3, en la que Z1 se selecciona de entre el grupo constituido por G y D;

Z2 se selecciona de entre el grupo constituido por L y K; y

Z3 se selecciona de entre el grupo constituido por S y T;

X6 está ausente o comprende un dominio de transducción; y

en la que u es 1-5.

En una forma de realización preferida, X4 está fosforilado. En una forma de realización preferida adicional, al menos uno de X2 y X6 comprende un dominio de transducción.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos según la fórmula general II:

1. Polipéptido que consiste en una secuencia según la fórmula general I:

X2-[X3-A (X4) APLP-X5-]U -X6

en la que X2 está ausente o comprende un dominio de transducción;

X3 es 0, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de la secuencia WLRR (SEC. ID. nº: 1) ;

X4 se selecciona de entre el grupo constituido por S, T, Y, D, E, fosfoserina y fosfotirosina;

X5 es 0, 1, 2 o 3 aminoácidos de una secuencia del género Z1-Z2-Z3,

en la que Z1 se selecciona de entre el grupo constituido por G y D;

Z2 se selecciona de entre el grupo constituido por L y K; y

Z3 se selecciona de entre el grupo constituido por S y T; y

X6 está ausente o comprende un dominio de transducción; y

en la que u es 1-5, y

en la que por lo menos uno de entre X2 y X6 comprende un dominio de transducción.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que X4 está fosforilado.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el dominio de transducción se selecciona de entre el grupo constituido por (R) 4-9 (SEC. ID. nº: 279) ; GRKKRRQRRRPPQ (SEC. ID. nº: 280) ; AYARAAARQARA (SEC. ID. nº: 281) ; DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEC. ID. nº: 282) ; GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEC ID. nº: 283) ; PLSSIFSRIGDP (SEC. ID. nº: 284) ; AAVALLPAVLLALLAP (SEC. ID. nº: 285) ; AAVLLPVLLAAP (SEC. ID. nº: 286) ; VTVLALGALAGVGVG (SEC. ID. nº: 287) ; GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP (SEC. ID. nº: 288) ; GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEC. ID. nº: 289) ; KLALKLALKALKAALKLA (SEC. ID. nº: 290) ; KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEC ID nº: 291) ; KAFAKLAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 292) ; KAFAKLAARLYRAAGC (SEC. ID. nº: 293) ; AAFAKLAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 294) ; KAFAALAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 295) ; KAFAKLAAQLYRKAGC (SEC. ID. nº: 296) y AGGGGYGRKKRRQRRR (SEC. ID. nº: 306) .

4. Polipéptido que comprende una secuencia según la fórmula general II: X2-[X3-A (X4) APLP-X5]u-X6

en la que X2 está ausente o comprende un dominio de transducción celular;

X3 es 0 a 14 aminoácidos de la secuencia de la proteína 20 del choque térmico entre los restos 1 y 14 de la SEC.

ID. nº: 297; X4 se selecciona de entre el grupo constituido por S, T, Y, D, E, fosfoserina y fosfotirosina; X5 es de 0 a 140 aminoácidos de la proteína 20 del choque térmico entre los restos 21 y 160 de la SEC. ID. nº: 297; X6 está ausente o comprende un dominio de transducción celular, y en la que por lo menos uno de entre X2 y X6 comprende un dominio de transducción.

5. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que el polipéptido comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: X2-SEC. ID. nº.

29. X6; X2-SEC. ID. nº.

29. X6; X2-SEC. ID. nº.

29. X6; X2-SEC. ID. nº.

30. X6; X2-SEC. ID. nº.

30. X6 y X2-SEC. ID. nº.

30. X6.

6. Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos X2-SEC. ID. nº: 300, en el que la SEC. ID. nº: 300 es WLRRASAPLPGLK, en la que el resto S en el polipéptido está fosforilado opcionalmente.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos X2-SEC. ID. nº: 300, en la que la SEC. ID. nº: 300 es WLRRASAPLPGLK, en la que el resto S en el polipéptido está fosforilado opcionalmente.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en el que tanto X2 como X6 comprenden un dominio de transducción.

9. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que X4 está fosforilado.

10. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que el resto S en el polipéptido está fosforilado.

11. Polipéptido según la reivindicación 7, en el que el resto S en el polipéptido está fosforilado.

12. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en el que el dominio de transducción se selecciona de entre el grupo constituido por: (R) 4-9 (SEC. ID. nº: 279) ; GRKKRRQRRRPPQ (SEC. ID. nº: 280) ; AYARAAARQARA (SEC. ID. nº: 281) ; DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEC. ID. nº: 282) ; GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEC ID. nº: 283) ; PLSSIFSRIGDP (SEC. ID. nº: 284) ; AAVALLPAVLLALLAP (SEC. ID. nº: 285) ; AAVLLPVLLAAP (SEC. ID. nº: 286) ; VTVLALGALAGVGVG (SEC. ID. nº: 287) ; GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP (SEC. ID. nº: 288) ; GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEC. ID. nº: 289) ; KLALKLALKALKAALKLA (SEC. ID. nº: 290) ; KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEC ID nº: 291) ; KAFAKLAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 292) ; KAFAKLAARLYRAAGC (SEC. ID. nº: 293) ; AAFAKLAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 294) ; KAFAALAARLYRKAGC (SEC. ID. nº: 295) ; KAFAKLAAQLYRKAGC (SEC. ID. nº: 296) y AGGGGYGRKKRRQRRR (SEC. ID. nº: 306) .

13. Composición farmacéutica, que comprende uno o más polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Secuencia aislada de ácido nucleico que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Vector de expresión, que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Célula anfitriona que comprende el vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Dispositivo biomédico, en el que el dispositivo biomédico comprende uno o más polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 dispuestos sobre o en el dispositivo biomédico.

18. Dispositivo biomédico según la reivindicación 17, en el que el dispositivo biomédico se selecciona de entre el grupo constituido por endoprótesis vasculares, injertos, derivaciones y fístulas.

19. Utilización de uno o más de los polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición a la proliferación y/o migración de células de músculo liso, en la que el medicamento debe ser administrado para entrar en contacto con las células de músculo liso y en una cantidad eficaz para inhibir la proliferación y/o migración de células de músculo liso, en la que el trastorno que debe tratarse o evitarse se selecciona de entre el grupo constituido por hiperplasia de la íntima, estenosis, restenosis, vasculopatía del trasplante, tumores de células de músculo liso y aterosclerosis.

20. Utilización según la reivindicación 19, en la que el medicamento debe ser administrado a un paciente que se ha sometido, se somete o se someterá a una intervención seleccionada de entre el grupo constituido por angioplastia, colocación de una endoprótesis vascular, endoarteriectomía, aterectomía, cirugía de bypass, injerto vascular, trasplante de órganos, colocación de implante protésico, reconstrucciones microvasculares, construcción quirúrgica plástica del colgajo y colocación del catéter.

21. Utilización según la reivindicación 19, en la que el tumor de células de músculo liso es un leiomiosarcoma.

22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que la puesta en contacto comprende poner en contacto con un vaso sanguíneo.

23. Utilización de uno o más polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o inhibición de un trastorno seleccionado de entre el grupo constituido por hiperplasia de la íntima, estenosis, restenosis y/o aterosclerosis, en la que el medicamento debe ser administrado a un paciente en una cantidad eficaz para el tratamiento o inhibición.

24. Utilización según la reivindicación 23, en la que el paciente que se ha sometido, se somete o se someterá a una intervención seleccionada de entre el grupo constituido por angioplastia, colocación de una endoprótesis vascular, endoarteriectomía, aterectomía, cirugía de bypass, injerto vascular, trasplante de órganos y colocación del catéter.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que el medicamento debe ser administrado para entrar en contacto con un vaso sanguíneo.

26. Utilización de uno o más polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o inhibición del espasmo del músculo liso, estando el medicamento destinado a ser administrado a un paciente en una cantidad eficaz para el tratamiento o inhibición.

27. Utilización sergún la reivindicación 26, en la que el trastorno que debe tratarse o evitarse es el vasoespasmo.

28. Utilización según la reivindicación 27, en la que el vasoespasmo está asociado a un trastorno o enfermedad seleccionado de entre el grupo constituido por angina de pecho, vasoespasmo coronario, angina de Prinzmetal, isquemia coronaria, accidente cerebrovascular, bradicardia, hipertensión, hipertensión pulmonar (pulmón) , asma (broncoespasmo) , toxemia del embarazo, parto prematuro, preeclampsia/eclampsia, enfermedad de Raynaud, fenómeno de Raynaud, uremia hemolítica, isquemia mesentérica no oclusiva, fisura anal, acalasia, impotencia, jaqueca, lesión muscular isquémica asociada al espasmo de músculo liso y vasculopatía.

29. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en la que el medicamento está destinado a entrar en contacto con un vaso sanguíneo.

30. Utilización de uno o más polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición del espasmo del músculo liso, en la que el medicamento está destinado a ser administrado a un paciente en una cantidad eficaz para inhibir la vasoconstricción.

31. Utilización según la reivindicación 30, en la que el trastorno que debe tratarse es el vasoespasmo.

32. Utilización según la reivindicación 30, en la que el trastorno que debe tratarse es una hiperplasia de la íntima.

33. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, en la que el polipéptido comprende un polipéptido con la secuencia de aminoácidos X2-SEC. ID. nº: 300, en la que la SEC. ID. nº: 300 es WLRRASAPLPGLK, en la que el resto S en el polipéptido está opcionalmente fosforilado.

34. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, en la que el polipéptido consiste en un polipéptido con la secuencia de aminoácidos X2-SEC. ID. nº: 300, en la que la SEC. ID. nº: 300 es WLRRASAPLPGLK, en la que el resto S en el polipéptido está opcionalmente fosforilado.

35. Utilización según la reivindicación 33, en la que el resto S en el polipéptido está fosforilado.

36. Utilización según la reivindicación 34, en la que el resto S en el polipéptido está fosforilado.