Proceso para la identificación de compuestos para el tratamiento del cáncer.

Un proceso para la identificación de compuestos para su uso como agentes terapéuticos para tratar cáncer quecomprende las etapas de:

a) Poner en contacto el compuesto candidato con un cultivo de células cancerosas o línea celular cancerosaderivada de células cancerosas;

b) Determinar el nivel de activación de una MDA-5 de la familia de las helicasas o el nivel de expresión deNOXA, en combinación con la determinación de la inducción de autofagia en células cancerosas o en unalínea celular cancerosa derivada de células cancerosas;

c) Comparar los datos obtenidos en la etapa b) con los observados en el control de las mismas célulastratadas de forma similar, pero en ausencia del compuesto candidato;

d) Seleccionar los compuestos que han dado lugar a un aumento significativo del parámetro o parámetrosdeterminados en la etapa b) en comparación con el control

Proceso para la identificación de compuestos para el tratamiento del cáncer

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere al campo de la oncología y se centra principalmente en identificar compuestos que pueden usarse para tratar diferentes tipos de cáncer, por ejemplo: melanoma, páncreas, colon, vejiga, glioma, mama, próstata, pulmón y carcinoma de ovario.

Además, la presente invención también abarca los compuestos identificados por un proceso tal, por ejemplo el compuesto BO-110 (véase posteriormente) , que es capaz de promover una muerte celular de tumor claro en todos los tipos de cáncer anteriormente indicados.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El melanoma sigue siendo un prototipo de cánceres sólidos con incidencia creciente y pronóstico extremadamente negativo en etapas avanzadas (Jemal et al., 2008) . Se ha empleado considerable esfuerzo para la identificación de determinantes moleculares que subyacen en la quimio e inmunorresistencia de melanoma. Los únicos agentes aprobados por la Agencia de Fármacos y Alimentos de los EE.UU. (FDA) para el tratamiento del melanoma metastásico son el agente alquilante dacarbazina (DTIC) y el inmunomodulador IL-2 (Tawbi y Kirkwood, 2007) . Sin embargo, rara vez más del 5 % de los pacientes se benefician de respuestas completas y duraderas en melanoma metastásico, y las toxicidades secundarias pueden ser graves. En consecuencia, la supervivencia media actual de los pacientes con melanoma metastásico es de 6 a 10 meses y, por ello, el desarrollo de terapias mejoradas es una prioridad en esta enfermedad (Jemal et al. 2007) .

Inicialmente, se pensó que el análogo sintético de ARNbc viral llamado pIC (ácido poliinosin-policitidílico) , un compuesto que se ha utilizado durante más de cuatro décadas para estimular el sistema inmune de manera dependiente de IFN (Field et al. 1967) , era un agente terapéutico prometedor contra el melanoma. Desgraciadamente, los estudios clínicos con pIC desnudo revelaron su baja estabilidad, baja inducción de IFN y ausencia de efecto antitumoral para melanoma (Robinson et al., 1976) . Por lo tanto, se considera que el pIC como agente sencillo es un pobre agente antimelanoma.

Los análisis histogenéticos de alto rendimiento y los estudios sistemáticos funcionales han supuesto avances significativos en nuestra comprensión del inicio y progresión del melanoma, y los complejos mecanismos asociados con el fracaso de los tratamientos (Fecher et al., 2007; Gray-Schopfer et al., 2007) . Se están identificando defectos consistentes y alteraciones en las cascadas de señalización de BRAF/MAPK, PI3K/AKT, NF-KB 0 NOTCH, proporcionando una plataforma excitante para el diseño racional de fármacos (Gray-Schopfer et al., 2007) . Sin embargo, la terapia dirigida no ha demostrado ser eficaz en ensayos sobre melanoma (Flaherty, 2006) . Los programas de muerte celular controlados por mitocondrias y/o el retículo endoplásmico están también en evaluación, aunque demuestran ser invariablemente ineficaces in vivo (Hersey y Zhang, 2008) . En consecuencia, o bien los fármacos antineoplásicos actuales no alcanzan su diana o sus dianas de manera eficaz, o tienen que administrarse en regímenes de dosificación que dan lugar a niveles de toxicidad inaceptables para los compartimentos celulares normales (Tawbi y Kirkwood, 2007) . Es importante mencionar que durante el tratamiento pueden activarse mecanismos compensatorios, que seleccionan poblaciones de células con una quimiorresistencia aun mayor (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007) .

De hecho, se considera que el melanoma presenta una capacidad notoria para eludir la apoptosis a través de distintas rutas, lo que le confiere al melanoma la capacidad de progresar, formar metástasis y sobrevivir a tratamiento con diferentes terapias (revisado por Ivanov et al., 2003) .

A diferencia de la quimioterapia convencional, cuyo objetivo es matar células tumorales principalmente desde “dentroquot; (es decir, activando programas intrínsecos de muerte celular) , la inmunoterapia tradicionalmente, ha implicado una cascada indirecta de interacciones célula-célula. En el melanoma, la mayor parte de los esfuerzos se han centrado en incrementar los niveles o la eficacia funcional de dos compartimentos: las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T citotóxicos (Wilcox y Markovic, 2007) . También se están ensayando vacunas, así como anticuerpos dirigidos contra inmunomoduladores inhibidores (p. ej. CTL4) , aunque con resultados frustrantes en los ensayos clínicos en fase IV (Kirkwood et al., 2008) . Más recientemente, se está persiguiendo la estimulación del sistema inmune innato mediante la activación de receptores de tipo Toll (TLR) -3, -4, -7 y -9, para apoyar la destrucción citotóxica de las células de melanoma mediante linfocitos citolíticos naturales (NK) , células dendríticas (DC) y linfocitos T (para revisiones recientes, véanse Kirkwood et al., 2008, o Tormo et al. 2007) . Sin embargo, múltiples estudios, incluyendo de los inventores, han demostrado una capacidad inherente de las células para eludir las terapias inmunológicas regulando negativamente (editando) marcadores inmunorreactivos de superficie. Los melanomas también pueden ejercer efectos supresores sobre el hospedador (p. ej., inhibición de la maduración de las células presentadoras de antígenos o bloqueo de la activación completa de linfocitos T) (Tormo et al., 2006; Ilkovitch y Lopez, 2008; Verma et al., 2008) . Por lo tanto, los melanomas presentan una capacidad inherente para eludir la actividad antitumoral de los inmunomoduladores.

En el campo de la inmunoterapia, una de las moléculas cuyo aumento de expresión se ha estudiado como un potencial factor positivo en la terapia de melanoma es MDA-5 (gen asociado a la diferenciación de melanoma 5) , un producto inicialmente descrito como un gen asociado con la diferenciación del melanoma (Kang et al., 2002) . MDA-5 es una helicasa que reconoce y se activa por ARN bicatenario (ARNbc) largo (Yoneyama et al., 2005) . Otras helicasas de ARN son RIG-I (proteína inducible por ácido retinoico 1, también llamada Ddx58) , que reconoce 3 fosfatos desnudos de ARNbc corto y LGP2 (también llamada Ddx58) , que es un regulador negativo en la detección de ARNbc.

Siempre que puedan generarse ARNbc largos por y durante infecciones virales, MDA-5 actúa como una primera línea de inmunidad innata frente a patógenos virales (Akira et al., 2006) . Además, MDA-5 tiene dominios de reclutamiento de activación de caspasas (CARD) . Juntos la helicasa y los dominios CARD activan NF-KB y 0tr0s fact0res de transcripción implicados en la regulación de citocinas (Kawai et al., 2005) . Por lo tanto, la función mejor conocida de MDA-5 es la estimulación inmune.

Desde una perspectiva terapéutica, se sabe que tanto IFN-1 como ARNbc inducen la transcripción del gen Mda-5. Por lo tanto se ha propuesto que ARNbc tiene un papel en el aumento de la expresión de Mda-5 en la inhibición del crecimiento inducido por IFN. Además se ha mostrado (Kang et al., 2002) que la inducción del MDA-5 endógeno mediante IFN-1 es citostática (en otras palabras, detiene el ciclo celular) . Por lo tanto, para activar muerte celular tumoral, MDA-5 tuvo que sobreexpresarse ectópicamente a niveles elevados (Kovacsovics et al., 2002) . Además, esta actividad pro-apoptótica de la expresión ectópica de MDA-5 no es eficaz en células tumorales con una ruta RAS/MEK/ERK hiperactiva (Lin et al., 2006) , como es el caso de los melanomas (Chin et al., 2006) . Por lo tanto una cuestión pendiente en el campo era como activar la MDA-5 endógena con los agentes quimioterapéuticos de una manera exclusiva para el compartimento del tumor (sin inducir toxicidades secundarias en células normales) .

La solicitud de patente de Estados Unidos US 2007/0259372 propone la identificación de agonistas o antagonistas del IFN-1, IFN-a o IFN-y por compuestos capaces de potenciar la expresión de MDA-5. La patente sugiere también que los inductores de la expresión del gen Mda-5 (por medio de su promotor) pueden considerarse compuestos candidatos para inducir la diferenciación terminal de células tumorales. También sugiere un posible papel de MDA-5 en la generación de señales apoptóticas a través de su dominio CARD. Sin embargo, hasta el momento, no se conocía cuáles eran las dianas de MDA-5 capaces de desencadenar apoptosis, y cómo activarlas de manera trazable y selectiva para las células tumorales. Además, como las células de melanoma tienen una ruta activa de RAS/MEK/ERK (que inhibe MDA5) , así como una notable capacidad para eludir la muerte celular apoptótica no fue obvio que las señales apoptóticas mediadas por MDA-5 fueran un mecanismo válido para... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la identificación de compuestos para su uso como agentes terapéuticos para tratar cáncer que comprende las etapas de:

a) Poner en contacto el compuesto candidato con un cultivo de células cancerosas o línea celular cancerosa derivada de células cancerosas;

b) Determinar el nivel de activación de una MDA-5 de la familia de las helicasas o el nivel de expresión de NOXA, en combinación con la determinación de la inducción de autofagia en células cancerosas o en una línea celular cancerosa derivada de células cancerosas;

c) Comparar los datos obtenidos en la etapa b) con los observados en el control de las mismas células tratadas de forma similar, pero en ausencia del compuesto candidato;

d) Seleccionar los compuestos que han dado lugar a un aumento significativo del parámetro o parámetros determinados en la etapa b) en comparación con el control.

2. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la determinación de la inducción de autofagia se realiza comprobando el nivel de expresión, la presencia de modificaciones postraduccionales o la localización intracelular de una proteína de autofagia.

3. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la inducción de autofagia se determina por una técnica seleccionada del grupo:

i. Cambio de movilidad electroforética de la proteína LC3, o

ii. Detección de la formación de focos de la proteína LC3.

4. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la inducción de autofagia se determina comprobando la presencia de autofagosomas por observación microscópica de los mismos.

5. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la presencia de autofagosomas se comprueba usando microscopia electrónica de transmisión.

6. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se determinan el nivel de activación de MDA-5, el nivel de expresión de NOXA y la inducción de autofagia.

7. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, para la identificación de compuestos para su uso como agentes terapéuticos para tratar melanoma que comprende las etapas de:

a) Poner en contacto el compuesto candidato con un cultivo de células de melanoma, o una línea celular derivada de células de melanoma;

b) Determinar el nivel de activación de una MDA-5 de la familia de las helicasas o el nivel de expresión de NOXA, en combinación con la determinación de la inducción de autofagia en células cancerosas o en una línea celular cancerosa derivada de células cancerosas;

c) Comparar los datos obtenidos en la etapa b) con los observados en el control de las mismas células tratadas de forma similar, pero en ausencia del compuesto candidato; d) Seleccionar los compuestos que han dado lugar a un aumento significativo del parámetro o parámetros determinados en la etapa b) en comparación con el control.

8. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la línea celular se selecciona del grupo de líneas celulares humanas: SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 y SK-Mel-147, y células de ratón B16.

9. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, para la identificación de compuestos para su uso como agentes terapéuticos para tratar al menos uno de los siguientes tipos de cáncer: carcinoma de páncreas, colon, vejiga, mama, próstata, pulmón y ovario que comprende las etapas de:

a) Poner en contacto el compuesto candidato con un cultivo de células cancerosas de al menos uno de los tipos de cáncer anteriormente mencionados o una línea celular derivada de al menos uno de los tipos de cáncer anteriormente mencionados;

b) Determinar el nivel de activación de una MDA-5 de la familia de las helicasas o el nivel de expresión de NOXA, en combinación con la determinación de la inducción de autofagia en células cancerosas o en una línea celular cancerosa derivada de células cancerosas;

c) Comparar los datos obtenidos en la etapa b) con los observados en el control de las mismas células tratadas de forma similar, pero en ausencia del compuesto candidato; d) Seleccionar los compuestos que han dado lugar a un aumento significativo del parámetro o parámetros determinados en la etapa b) en comparación con el control.

10. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la línea celular se selecciona del grupo de líneas celulares de cáncer de páncreas: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 y Panc-1; o del grupo de líneas celulares de cáncer de colon: CACO, SW480 y SW1222; o del grup0 de lineas celulares de cancer de vejiga: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 y SW1170; o del grupo de líneas celulares de glioma: U87MG, U251 y T98G; o del grupo de líneas celulares de cáncer de mama: MDA231, MCF7 y T47D; o del grupo de líneas celulares de cáncer de próstata: LNCaP, PC3 y DU145;

o del grup0 de lineas celulares de cancer de pulmon: H1299 y NCI H460; 0 del grup0 de lineas celulares de cancer de 0vari0: NCI H23, CHQK1 y SK-OV-3.

11. El proceso, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto seleccionado consiste en una combinación de ARN bicatenario, (ARNbc) que contiene al menos 1000 nucleótidos de longitud por cadena y un policatión.

12. El proceso, de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el compuesto seleccionado consiste en una combinación de ácido poliinosin-policitidílico (pIC) que contiene al menos 1000 nucleótidos de longitud por cadena y polietilenimina (PEI) .

13. Compuesto que consiste en una combinación de ácido poliinosin-policitidílico (pIC) que contiene al menos 1000 nucleótidos de longitud por cadena y polietilenimina (PEI) para su uso como medicamento.

14. Compuesto, de acuerdo con la reivindicación 13, que consiste en una combinación de ácido poliinosin-policitidílico (pIC) que contiene al menos 1000 nucleótidos de longitud por cadena y polietilenimina (PEI) para su uso en el tratamiento del cáncer.

15. Composición farmacéutica que comprende el compuesto de las reivindicaciones 13 ó 14 para su uso como medicamento.

16. Composición farmacéutica que comprende el compuesto de las reivindicaciones 13 ó 14, de acuerdo con la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de cáncer.

17. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de un tipo de cáncer caracterizado por presentar activación de una MDA-5 de la familia de las helicasas o la expresión de NOXA, en combinación con biomarcadores relacionados con la inducción de autofagia.

18. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de melanoma.

19. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de al menos uno de los siguientes tipos de cáncer: carcinoma de páncreas, colon, vejiga, mama, próstata, pulmón y ovario.

FIGURA 4C (Cont.)

FIGURA 15

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción Literatura no patente citada en la descripción