Modelo animal mal para el estudio de la angiogenesis y linfoangiogenesis in vivo.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran la construcción IRES-EGFP -Luciferasa en la región 3''UTR del gen FLt4, y que es capaz de reportar la expresión del gen FLt4 con un patrón idéntico al de la expresión del receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil en el estudio y evaluación de la progresión de las enfermedades que cursan con línfoangiogénesís, angiogénesis y/o inflamación, así como para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas

Modelo animal para el estudio de la angiogénesis y linfoangiogénesis in vivo.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4, y que es capaz de reportar la expresión del gen Flt4 con un patrón idéntico al de la expresión del receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil en el estudio y evaluación de la progresión de las enfermedades que cursan con linfoangiogénesis, angiogénesis y/o inflamación, así como para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas.

Estado de la técnica anterior

El gen Flt4 codifica para el receptor VEGFR-3, un receptor de membrana con actividad tirosina-quinasa que pertenece a la familia de receptores de factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF A-D). Esta familia de receptores (VEGFR 1-3) tiene un patrón de expresión relativamente específico de células endoteliales de vasos sanguíneos y linfáticos y son reguladores muy importantes de los procesos de angiogénesis y neovascularización, ya que participan en el control de la proliferación, migración y diferenciación de las células endoteliales.

El receptor VEGFR-3 comienza a expresarse en el ratón durante el desarrollo embrionario aproximadamente en el día 8 de gestación en los vasos sanguíneos primordiales, pero su expresión se restringe a los vasos linfáticos en el momento en que estos se desarrollan. De hecho, a día 12 del desarrollo embrionario la expresión de VEGFR-3 ya se detecta fundamentalmente en los vasos linfáticos (nuestros propios resultados). En el animal adulto, se ha descrito que en condiciones fisiológicas VEGFR-3 se expresa mayoritariamente en células endoteliales de los vasos linfáticos, y se considera un buen marcador de este tipo celular ya que al contrario que los receptores VEGFR-1 y -2, VEGFR-3 no se encuentra expresado en el endotelio de los vasos sanguíneos adultos, en condiciones fisiológicas.

Aunque específico de células endoteliales linfáticas, la expresión de VEGFR-3 en adulto es baja en condiciones basales. En el ratón se observa una caída dramática de los niveles de expresión entre animales jóvenes (1-5 semanas) y animales adultos (más de 6 semanas).

En general, existe una correlación tanto a nivel espacial como temporal entre la expresión de receptores de VEGF y procesos de angiogénesis. Así, en adultos la expresión de estos receptores se encuentra incrementada asociada a cicatrización tisular, inflamación, crecimiento tumoral y formación de metástasis, todos ellos, procesos que dependen de la formación y crecimiento de nuevos vasos a partir de los ya existentes.

Actualmente existe un modelo desarrollado por Xenogen Corporation basado en las señales de expresión del receptor VEGFR-2 (Flk1/KDR) (Zhang et al., 2004. Blood, 103, 617-626. US 6,867,348). Se trata de un ratón genéticamente modificado en el cual dos fragmentos del gen Flk1 del ratón conteniendo las secuencias del promotor y enhancer respectivamente se han clonado en un plásmido que contiene la secuencia que codifica la enzima luciferasa. Esta construcción ha sido introducida en el genoma del ratón al azar mediante microinyección en pronúcleos de embriones de una célula.

Además se han desarrollado otros modelos reporter basados en las señales de expresión de otros genes cuya expresión es específica de células endoteliales. Dos líneas transgénicas han sido desarrolladas por diferentes laboratorios en las que el gen de la EGFP (enhanced green fluorescent protein) se expresa bajo el control del promotor o promotor/enhancer de los receptores Tie1 (Iljin et al., 2002. Faseb J, 16, 1764-1774) y Tie2 (Motoike et al., 2000; Genesis, 28, 75-81) respectivamente. Tie1 y Tie2 se expresan durante el desarrollo embrionario en el ratón, en angioblastos y en células endoteliales. En el organismo adulto la expresión endógena de estos receptores en el endotelio se mantiene a niveles más bajos, y se induce en sitios de neovascularización como el ovario durante la formación del cuerpo lúteo y en procesos de cicatrización. Sin embargo, la expresión de genes reporter bajo el control de secuencias reguladoras de estos genes en los correspondientes modelos genéticamente modificados, como la línea Tie1-EGFP no se induce en el endotelio durante la neovascularización tumoral. Esta inducción sí se ha observado, sin embargo, al reemplazar parte de la secuencia del gen Tie1 endógena por el gen lacZ, tal y como se hizo para la generación del knockout de Tie1 (Puri et al., 1995). La discrepancia entre el comportamiento de la línea knockout/knockin y la línea transgénica de Tie1 en cuanto a la activación de la expresión de Tie1 durante la angiogénesis tumoral refleja la limitación de las líneas transgénicas convencionales para reproducir fielmente la regulación de la expresión de los genes endógenos. Lo mismo se observa en una línea transgénica que expresa lacZ bajo el control del promotor de VEGFR-3, en la que no se reproduce por completo la expresión endógena del receptor (lljin et al., 2001).

Descripción de la invención

Los inventores han construido un modelo animal, un ratón modificado genéticamente mediante gene-targeting (knock-in) en el cual una proteína trazadora o reporter se expresara bajo el control de las señales de expresión del receptor VEGF-3. La expresión de este reporter puede ser monitorizada in vivo por técnicas no invasivas, lo que implica que se podría medir y cuantificar directamente en el ratón la angiogénesis asociada a diferentes procesos, tanto fisiológicos como patológicos a tiempo real.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un mamífero no humano genéticamente modificado, de ahora en adelante mamífero de la invención, cuyas células expresan la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4 con un patrón idéntico a la expresión del receptor VEGFR-3, tanto en el espacio como en el tiempo.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la expresión de la construcción IRES-EGFP-Luciferasa comprende la introducción de una secuencia de ácidos nucléicos que comprende la SEQ ID NO: 1 en el animal o uno de sus ancestros.

La secuencia SEQ ID NO: 1 comprende las secuencias de IRES del virus de la encefalomiocarditis, la secuencia de la EGFP y de la luciferasa.

Las secuencias IRES (del inglés "internal ribosome entry site") son secuencias nucleotídicas que permite la iniciación de la síntesis proteica en el medio de la traducción del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A diferencia del mecanismo más conocido de traducción proteica en organismos eucariontes que requiere una modificación previa en el extremo 5' del mRNA mensajero para el ensamblaje de la maquinaria de traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de pre-iniciación 43S, de manera que pueden comenzar la traducción del RNA mensajero a pesar de carecer de modificación Cap en su extremo 5'. Estas secuencias han sido encontradas en miembros de las familias virales picornavirus, retrovirus y herpesvirus. Además, recientemente se han encontrado secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes, especialmente en proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular, así como mecanismos apoptóticos. En el contexto de la presente invención se emplea como secuencias IRES, pero sin limitarnos, la secuencia IRES del virus de la encefalomiocarditis.

La EGFP según sus siglas en inglés (enhanced green fluorescent protein) es una mutación de una proteína (GFP) producida por la medusa Aequorea sp. (A. victoria, A. aequorea, A. forskalea) que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. Esta mutación (S65T) incrementa la fluorescencia, fotoestabilidad y posee unos picos de excitación y de emisión compatibles con los filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC), por lo que el gen que codifica esta proteína está aislado y se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador.

En esta memoria "luciferasa" se refiere a un término genérico que agrupa un grupo de enzimas capaces de producir bioluminiscencia en la naturaleza. La más conocida es la firefly luciferase, de Photinus...