Moléculas de unión a Cripto.

Una molécula de unión que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos CDR y marco que se indican en una secuenciaVL seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:

47 y en la SEQ ID NO: 50; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos CDR y marco que se indican en unasecuencia VH seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 51;

en donde la molécula de unión se une específicamente a un antígeno de Cripto humano.

Moléculas de unión a Cripto.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos, y sus diversas formas modificadas, son agentes terapéuticos eficaces que actualmente se utilizan para tratar a pacientes que padecen una serie de trastornos. Algunos de estos anticuerpos reconocen antígenos presentes en la superficie de las células tumorales. Cripto es una proteína de superficie celular de 188 aminoácidos sobrexpresada por muchas células tumorales. Se aisló cripto en una exploración de cDNA de una genoteca de carcinoma embrionario humano (Ciccodicola et al, 1989, EMBO J. 8:1987-91) . Cripto se clasificó originalmente como un miembro de la familia EGF (Ciccodicola et al., supra) ; no obstante, el análisis subsiguiente demostró que Cripto no se unía a ninguno de los receptores EGF conocidos y su dominio de tipo EGF era en realidad divergente de la familia EGF (Bianco et al., 1999, J. Biol Chem. 274:8624-29) .

La sobrexpresión de la proteína Cripto se asocia con tumores en muchos tejidos (incluidos, aunque sin limitarse a ello, los de cerebro, mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, cuello uterino, páncreas y estómago) . Panico et al., 1996, Int. J. Cancer 65:51-56; Byrne et al., 1998, J, Pathology 185:108-11; De Angelis et al, 1999, Int J. Oncology 14:437-40. Adkins et al., 2003, J. Clin. Invest 112 (4) : 575-587 describe que el bloqueo del anticuerpo del dominio CFC de Cripto suprime el crecimiento de células tumorales in vivo. El documento US 2004/0176576 describe un ligando aislado de una proteína a Cripto-1. Lepage et al. Proceedings of the 94 Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, 2003 julo 11-14, AACR, 44:145, Abstract #749 describe que un anticuerpo anti-Cripto conjugado al fármaco maitansinoide, DM1, causa la regresión de tumores preformados en modelos tumorales de xenoinjerto humanos.

Se han descrito anticuerpos murinos que se unen a Cripto. No obstante, si bien los anticuerpos murinos tienen aplicabilidad como agentes terapéuticos en seres humanos, dado que no son de origen humano pueden ser inmunogénicos. La administración de dichos anticuerpos puede resultar en una respuesta de anticuerpos neutralizadores (respuesta de anticuerpo antimurino humano (HAMA) ) , que es particularmente problemática si se desea administrar los anticuerpos repetidamente, p. ej., en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente. Además, dado que contienen dominios constantes murinos, no pueden exhibir funciones efectoras humanas.

En un esfuerzo por aliviar las inquietudes de inmunogenicidad, con frecuencia se producen anticuerpos “humanizados”. En un protocolo, las CDR de un anticuerpo de origen de ratón se transfieren a las regiones de marco humanas que resultan en un anticuerpo "injertado de CDR". Con frecuencia, los residuos de aminoácidos que podrían afectar potencialmente la unión del antígeno en la región de marco se retromutan al correspondiente residuo de ratón.

No obstante, si bien se desean los anticuerpos humanizados por su baja inmunogenicidad potencial en seres humanos, su producción es impredecible. Por ejemplo, la modificación de secuencias de anticuerpos puede resultar en pérdida sustancial o incluso total de afinidad de unión a antígenos, o pérdida de especificidad de unión. Asimismo, a pesar de la modificación de secuencias, los “anticuerpos humanizados” pueden incluso exhibir inmunogenicidad en seres humanos. El desarrollo de anticuerpos anti-Cripto humanizados sería muy beneficioso para inhibir las consecuencias de la expresión de Cripto en las células de pacientes. Además, el desarrollo de dichos anticuerpos proporcionaría un medio para direccionar las células tumorales positivas de Cripto con el fin de suministrar agentes antitumorales tales como toxinas, radiomarcadores y similares.

Compendio de la invención La descripción, que incluye la presente invención, se basa por lo menos en parte, en el desarrollo de anticuerpos injertados con CDR humanas y otros anticuerpos anti-Cripto humanizados. Como se describirá en más detalle a continuación, se desarrollaron múltiples formas de anticuerpos anti-Cripto humanizados y se conjugaron a maitasinoides para ensayar el crecimiento de tumores en modelos animales. Los resultados se presentan en los presentes ejemplos que demuestran la utilidad de estos anticuerpos para la inhibición del crecimiento de células tumorales in vivo. Estos anticuerpos anti-Cripto humanizados son más adecuados que los anticuerpos de ratón para uso en sujetos humanos.

Se han efectuado tanto anticuerpos humanizados de longitud total como anticuerpos humanizados que carecen del dominio CH2. Las composiciones de anticuerpos que carecen del dominio CH2 comprenden una mezcla de moléculas de unión diméricas que comprenden diferentes isoformas (moléculas que comprenden dos porciones de cadena pesada en las que una fracción de las moléculas comprende dos porciones de cadena pesada que están unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas (Forma A) y una porción de las moléculas comprende dos porciones de cadena pesada que no están unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas (Forma B) ) . Una forma o la otra puede obtenerse preferencialmente, p. ej., por separación usando cromatografía de interacción hidrófoba o por inclusión de péptidos conectores sintéticos que producen biosíntesis preferencial o bien de la Forma A o de la Forma B. Los péptidos conectores de la descripción pueden incluirse en cualquier molécula dimérica que tienda a formar tanto la Forma A como la Forma B, p. ej., moléculas de anticuerpos, moléculas de anticuerpos que carecen del dominio (p.ej., que carecen de todo o parte del dominio CH2) , minicuerpos, diacuerpos, proteínas de fusión, etc. En un ejemplo preferido, se potencia la formación de la Forma A. Los dímeros del polipéptido de la Forma A exhiben mejor estabilidad in vitro y mejor biodistribución in vivo.

En base a la descripción del presente documento, la presente invención da a conocer una molécula de unión que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR y marco que se indican en la secuencia VL seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 47 y en la SEQ ID NO: 50; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR y de marco que se indican en la secuencia VH seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 51;

donde la molécula de unión se une específicamente a un antígeno de Cripto humano. Los aspectos y realizaciones adicionales se exponen en las reivindicaciones anejas.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 48.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 49.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 51.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 48.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 49.

En una realización, la molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50 y una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 51.

En una realización, la cadena pesada de la molécula de unión comprende un domino CH3 genéticamente condensado al dominio VH, VL o CH1 mediante un péptido conector sintético.

En una realización, las cadenas pesadas de la molécula de unión carecen de todo o parte de un dominio CH2.

En una realización, la molécula de unión comprende una región constante derivada... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de unión que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos CDR y marco que se indican en una secuencia VL seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 47 y en la SEQ ID NO: 50; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos CDR y marco que se indican en una secuencia VH seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 51;

en donde la molécula de unión se une específicamente a un antígeno de Cripto humano.

2. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 48.

3. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 49.

4. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 47; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 51.

5. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50, and

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 48.

6. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50; y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 49.

7. La molécula de unión según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 50, y

(b) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 51.

8. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la cadena pesada de la molécula de unión comprende un dominio CH3 genéticamente condensado a un dominio VH, VL o CH1 mediante un péptido conector sintético.

9. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la cadena pesada de la molécula de unión carece de todo o parte del dominio CH2.

10. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende una región constante derivada de un anticuerpo de un isotipo seleccionado del grupo que consiste en: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

11. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la molécula de unión comprende una secuencia de aminoácidos que es una región bisagra seleccionada del grupo que consiste en: una bisagra y 1, una bisagra y 2, una bisagra y 3 y una bisagra y 4.

12. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la molécula de unión comprende una bisagra quimérica.

13. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que la molécula de unión comprende por lo menos una porción de un dominio bisagra IgG1, o por lo menos una porción de un dominio bisagra IgG3.

14. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la molécula de unión comprende una región constante de la cadena pesada que comprende un residuo cisteína en la posición 239 o 242, de acuerdo con el sistema de numeración Kabat.

15. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la molécula de unión comprende una región constante de la cadena pesada que comprende por lo menos una modificación de aminoácidos según lo comparado con la región Fc de tipo natural.

16. La molécula de unión según la reivindicación 15, en la que la modificación comprende una sustitución de aminoácidos en cualquiera de las posicione.

29. 299, de modo tal que la variante está sustancialmente aglicosilada cuando se expresa en una célula mamífera.

17. La molécula de unión según la reivindicación 15 o 16, en la que la molécula de unión tiene una función efectora reducida en comparación con una molécula que tiene una región Fc de tipo natural correspondiente.

18. La molécula de unión según la reivindicación 17, en la que la molécula de unión posee citotoxicidad dependiente del antígeno en comparación con una molécula de unión que tiene una región Fc de tipo natural correspondiente.

19. La molécula de unión según la reivindicación 17 o 18, en la que la molécula de unión tiene mejor semivida en comparación con una molécula de unión que tiene una región Fc de tipo natural correspondiente.

20. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 15-19, en la que la región Fc modificada tiene por lo menos un residuo cisteína genéticamente modificado.

21. La molécula de unión según la reivindicación 20, en la que el residuo cisteína genéticamente modificado está en el dominio CH3 de la región Fc.

22. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que está conjugada a un resto efector.

23. La molécula de unión según la reivindicación 22, en la que el resto efector se selecciona del grupo que consiste en una citotoxina, un profármaco, una toxina biológica y un radioisótopo.

24. La molécula de unión según la reivindicación 22, en la que el resto efector se conjuga mediante un enlace amida.

25. La molécula de unión según la reivindicación 23, en la que el resto efector es un maitansinoide.

26. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 53 y la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 56.

27. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la SEQ ID NO: 53 y la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos marco y CDR que se indican en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 57.

28. La molécula de unión según la reivindicación 27, que comprende una región constante de la cadena pesada del isotipo y 1.

29. La molécula de unión según la reivindicación 27, que comprende la secuencia de la región constante de la cadena pesada que se indica en la SEQ ID NO: 71.

30. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 53 y la cadena pesada tiene la secuencia expuesta como la SEQ ID NO: 58.

31. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 54 y la cadena pesada tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 56.

32. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 54 y la cadena pesada tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 57.

33. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que la cadena ligera tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 54 y la cadena pesada tiene la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 58.

34. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 que es biespecífica.

35. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 que es tetravalente.

36. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 que es un anticuerpo de longitud total.

37. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 que es un fragmento de anticuerpo.

38. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-33 que es una proteína de fusión.

39. La molécula de unión según la reivindicación 27, que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se indica en la SEQ ID NO: 53 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se indica en la SEQ ID NO: 57, en donde la molécula de unión está conjugada a un maitansinoide.

40. Una composición que comprende la molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-39 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

41. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada o ligera de una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-29.

42. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 41 que está en un vector.

43. Una célula hospedante que comprende el vector según la reivindicación 42.

44. Un método para producir la molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-39, que comprende cultivar la célula hospedante según la reivindicación 43 bajo condiciones tales que se produzca la molécula de unión, y aislar la molécula de unión de la célula hospedante o el cultivo.

45. Una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 23, 25 o 39 para tratar a un sujeto que se beneficiaría a partir del tratamiento con la molécula de unión.

46. La molécula de unión para uso según la reivindicación 45, en la que el sujeto padece cáncer.

47. La molécula de unión para uso según la reivindicación 45, en la que la molécula de unión se utiliza en combinación con un agente adicional.

48. La molécula de unión para uso según la reivindicación 47, en la que el agente adicional es un agente quimioterapéutico.

49. La molécula de unión para uso según la reivindicación 47, en la que el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en natalizumab, trastuzumab, bevacizumab, infliximab, rituximab, ibritumomab, tiuxetan, cetuximab, hidrocloruro de levamisol, tositumomab, alemtuzumab, IMC-C225, mesilato de imatinib, fulvestrant, anastrozol, exemestano, letrozol, tamoxifeno, interferón alfa, denileucina diftitox, oblimersen, erlotinib HCI, bortezomib, talidomida y endostatina.

50. Una molécula de unión según la reivindicación 39, para uso en el tratamiento de un tumor que sobrexpresa Cripto.

51. La molécula de unión según la reivindicación 50, en la que la molécula de unión es para usar en una dosis de por lo menos aproximadamente 5 mg/kg.

52. La molécula de unión para uso según la reivindicación 50, en la que la molécula de unión es para usar en una dosis de por lo menos aproximadamente 10 mg/kg.

53. La molécula de unión para uso según la reivindicación 50, en la que la molécula de unión es para usar por vía intraperitoneal, oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa.

54. La molécula de unión para uso según la reivindicación 50, en la que el paciente padece cáncer en un órgano seleccionado del grupo que consiste en cerebro, mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cuello uterino, páncreas y estómago.

55. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha secuencia VL 5 comprende además una secuencia de señalización.

56. La molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha secuencia VH comprende además una secuencia de señalización.

57. La molécula de unión según la reivindicación 55 o 56, en la que dicha secuencia VL comprende las SEQ ID NO:

o SEQ ID NO: 65, y en donde dicha secuencia VH comprende las SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 10 69.