Método y kits para diagnosticar una tumorigenicidad.

Un método para medir la concentración de GP88/PCDGF en una muestra de fluido biológico que comprende contactar dicha muestra con un anticuerpo anti-GP88/PCDGF o un fragmento de anticuerpo del mismo y medir la concentración de GP88/PCDGF en el que PCDGF es capaz de ser detectada en una concentración tan baja como 0,

1 nanogramos de GP88/PCDGF por mililitro, en el que el anticuerpo anti-GP88/PCDGF es producido de una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo que consta de ATCC Número de Acceso PTA-5262 (6B3), ATCC Número de Acceso PTA-5261 (6B2), ATCC Número PTA-5589 (2A5), ATCC Número PTA-5593 (4D1), ATCC Número PTA-5259 (3F5), ATCC Número PTA-5260 (5B4), y ATCC Número PTA-5591 (3F8).

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a biología celular, fisiología y medicina, y se refiere a un factor de crecimiento de la glicoproteína 88kDa (“GP88”) PCDGF. Más específicamente la invención se refiere a un kit de productos, composiciones y métodos que son útiles para el diagnóstico de enfermedades incluido el cáncer.

REFERENCIAS

Se hace referencia en este documento a varias publicaciones con números arábigos entre paréntesis. Todas las citas para estas referencias pueden encontrarse al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La proliferación y diferenciación de las células en organismos multicelulares está sujeta a un proceso altamente regulado. Una característica distintiva de las células cancerosas es la ausencia de control sobre este proceso; la proliferación y diferenciación se desregulan dando lugar a un crecimiento descontrolado. Se han dedicado importantes esfuerzos de investigación hacia un mejor entendimiento de esta diferencia entre las células normales y tumorales. Un área de enfoque de la investigación es la de los factores de crecimiento y, más específicamente, la estimulación del crecimiento autocrino.

Los factores de crecimiento son polipéptidos que llevan mensajes a las células respecto al crecimiento, diferenciación, migración y expresión genética. Normalmente, los factores de crecimiento son producidos en una célula y actúan sobre otra célula para estimular la proliferación. Sin embargo, ciertas células malignas, en cultivo, demuestran una dependencia mayor o absoluta de un mecanismo de crecimiento autocrino. Las células malignas que observan este comportamiento autocrino eluden la regulación de la producción del factor de crecimiento por otras células y están por tanto no reguladas en su crecimiento.

El estudio del control de crecimiento autocrino avanza la comprensión de los mecanismos de crecimiento celular y lleva a avances importantes en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Con este fin, se ha estudiado una serie de factores de crecimiento, incluyendo los factores de crecimiento similares a insulina (“IGF1” y “IGF-b”) , y el factor de crecimiento epidérmico (“EGF”) .

La presente invención está dirigida a un factor de crecimiento descubierto recientemente. Este factor de crecimiento fue descubierto primero en el medio de cultivo de “células PC” altamente tumorigénicas, una variante insulino-independiente aislada de la línea celular adipogénica 1246 derivada de teratoma. Este factor de crecimiento es referido en este documento como “GP88”, como PCDGF. GP88 se ha purificado y caracterizado estructuralmente.

La secuencia de aminoácidos del GP88 indica que GP88 tiene similitudes de secuencia de aminoácidos con el precursor de granulina/epitelina de ratón.

Las granulinas/epitelinas (“grn/epi”) son polipéptidos 6kDa y pertenecen a una familia nueva de polipéptidos ricos en cisteína doble. La patente U.S. No. 5, 416, 192 (Shoyab et al.) está dirigida a epitelinas 6 kDa, particularmente epitelina 1 y epitelina 2. Según Shoyab, ambas epitelinas están codificadas por un precursor 63.5 kDa común, que es procesado en formas más pequeñas tan pronto es sintetizado, de modo que los únicos productos naturales encontrados en muestras biológicas son las formas 6 kDa. Shoyab et al enseña que el precursor epitelina es biológicamente inactivo.

Contrariamente a las enseñanzas de Shoyab et al., el laboratorio del inventor ha demostrado que el precursor no es siempre procesado tan pronto como se sintetiza. Unos estudios, conducidos en parte por este inventor, han demostrado que el precursor (e.d., GP88) es de hecho secretado como una glicoproteína 88kDa con una fracción de carbohidrato unido a N de 20kDa. Análisis de la secuencia N-terminal de GP88 indican que GP88 comienza en el aminoácido 17 del precursor grn/epi, demostrando que los primeros 17 aminoácidos de la secuencia de la proteína deducidos del ADNc precursor corresponden a un péptido señal compatible con la orientación para la localización o para la secreción de la membrana. También en contraste con las enseñanzas de Shoyab et al., GP88 está biológicamente activado y tiene actividad promotora de crecimiento, particularmente como un factor autocrino de crecimiento para las células productoras.

El diagnóstico de cáncer a menudo requiere el estudio de una biopsia de un tejido sospechoso de ser tumorigénico, ensayando la muestra de tejido para determinar si está presente un etiquetador tumoral, y determinar si la muestra de tejido es tumorigénica. Los procedimientos de biopsia pueden ser arriesgados y dolorosos dependiendo de la ubicación del tejido y la condición del paciente. Además, el trauma provocado por los procedimientos de biopsia puede incrementar el riesgo de malignidad. Un estudio publicado en el British Medical Journal identificó la biopsia como el factor de riesgo más fuerte para el cáncer testicular. Swerdlow et al., BMJ 1997;314:1507. La biopsia ha sido también identificada como un factor de riesgo en el cáncer de mama, cáncer de hígado, y otros tipos de cáncer. En adición, un estudio conducido en la Universidad Johns Hopkins concluyó que los diagnósticos erróneos después de las biopsias suceden a un ritmo significativo. Kronz et al., Cancer: Dec. 1, 1999, Vol. 86, no. 11 pp 2426-2435. Un diagnóstico erróneo puede ser debido, en parte, a los pequeños tamaños de muestras obtenidas de las biopsias con aguja y otros procedimientos que capturan sólo pequeñas muestras de tejido. Pequeños tamaños de las muestras de biopsia reducen el riesgo del paciente.

Id. Sin embargo, el riego de un diagnóstico erróneo aumenta solo cuando una pequeña muestra de tejido es utilizada. Id.

US 6, 309, 826 enseña métodos de diagnóstico de tumorigenicidad que comprenden la medición del ácido nucleico de GP88.

US 6, 309, 826 también divulga anticuerpos anti-GP88 y el hecho que GP88 se encuentra en el suero de los ratones, tejido adiposo, cerebro, testículos, ovarios, hígado y riñón.

Lo que se necesita son nuevos métodos y kits para el diagnóstico, tratamiento, y prevención del cáncer, y particularmente métodos y kits que eviten riesgos asociados con la biopsia del tejido.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El inventor ha descubierto inesperadamente que una glicoproteína (GP88) , que se expresa de manera bien regulada en células normales, es sobreexpresada y no regulada en células altamente tumorigénicas derivadas de las células normales, que GP88 actúa como un estimulador de crecimiento rigurosamente necesario para las células tumorigénicas y que la inhibición de la expresión o acción de GP88 en las células tumorigénicas resulta en una inhibición de las propiedades tumorigénicas de las células sobreproductoras.

El inventor ha descubierto además métodos para la detección de GP88 en fluidos biológicos en concentraciones tan bajas como 0, 1 nanogramos de GP88 por mililitro (ng/ml) . La invención proporciona métodos y kits no invasivos para la detección de GP88 en un fluido biológico (ej., sangre entera, plasma, suero, linfa, saliva, y orina) .

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para medir la concentración de GP88/PCDGF en una muestra de fluido biológico que comprende contactar dicha muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-GP88/PCDGF de la misma y medir la concentración de GP88/PCDGF en el que PCDGF es capaz de ser detectado a una concentración tan baja como 0, 1 nanogramos de GP88/PCDGF por mililitro, en el que el anticuerpo anti-GP88/PCDGF es producido de una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo consistente en Número de Acceso ATCC PTA-5262 (6B3) , Número de Acceso ATCC PTA-5261 (6B2) , Número ATCC PTA-5589 (2A5) , Número ATCC PTA-5593 (4D1) , Número ATCC PTA-5259 (3F5) , Número ATCC PTA-5260 (5B4) , y Número ATCC PTA-5591 (3F8) . La muestra de fluido biológico puede ser una muestra de suero. La invención además proporciona un método para el diagnóstico de la actividad tumorigénica en células que comprende: medir el nivel de proteína GP88/PCDGF en una primera muestra de fluido biológico tomada de un paciente; medir el nivel de proteína GP88/PCDGF en una segunda muestra de fluido biológico tomada de un paciente; y diagnosticar la actividad tumorigénica en las células determinando si el nivel medido de la proteína GP88/PCDGF en dicha segunda muestra es mayor que el nivel en dicha primera muestra en una cantidad suficiente para indicar actividad tumorigénica en las células, en el que la... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir la concentración de GP88/PCDGF en una muestra de fluido biológico que comprende contactar dicha muestra con un anticuerpo anti-GP88/PCDGF o un fragmento de anticuerpo del mismo y medir la concentración de GP88/PCDGF en el que PCDGF es capaz de ser detectada en una concentración tan baja como 0, 1 nanogramos de GP88/PCDGF por mililitro, en el que el anticuerpo anti-GP88/PCDGF es producido de una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo que consta de ATCC Número de Acceso PTA-5262 (6B3) , ATCC Número de Acceso PTA-5261 (6B2) , ATCC Número PTA-5589 (2A5) , ATCC Número PTA-5593 (4D1) , ATCC Número PTA-5259 (3F5) , ATCC Número PTA-5260 (5B4) , y ATCC Número PTA-5591 (3F8) .

2. Un método para diagnosticar actividad tumorigénica en células que comprende: medir el nivel de la proteína GP88/PCDGF en una primera muestra de fluido biológico tomada de un paciente; medir el nivel de la proteína GP88/PCDGF en una segunda muestra de fluido biológico tomada de un paciente; y diagnosticar actividad tumorigénica en células determinando si el nivel medido de la proteína GP88/PCDGF en dicha segunda muestra es mayor que el nivel en dicha primera muestra en una cantidad suficiente para indicar actividad tumorigénica en células, en el que medir el nivel de GP88/PCDGF se realiza usando el método de la reivindicación 1.

3. Un método para diagnosticar actividad tumorigénica en células que comprende medir el nivel de GP88/PCDGF en una muestra de fluido biológico usando un anticuerpo anti-GP88/PCDGF, y determinar si el nivel de GP88/PCDGF en dicha muestra es suficiente para indicar actividad tumorigénica en células, en el que medir el nivel de GP88/PCDGF se lleva a cabo usando el método de la reivindicación 1.

4. Un método para determinar si un paciente responde o es sensible a terapia anti-tumorigénica, que comprende medir la concentración de GP88/PCDGF en una muestra de fluido biológico de un paciente y determinar si la concentración de GP88/PCDGF en dicha muestra es suficiente para indicar que dicho paciente no responde

o no es sensible a terapia anti-tumorigénica, en el que medir el nivel de GP88/PCDGF se lleva a cabo usando el método de la reivindicación 1.

5. Un anticuerpo anti-GP88/PCDGF producido a partir de una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo consistente de Número de Acceso ATCC PTA-5262 (6B3) , Número de Acceso ATCC PTA-5261 (6B2) , Número ATCC PTA-5589 (2A5) , Número ATCC PTA-5593 (4D1) , Número ATCC PTA-5259 (3F5) , Número ATCC PTA-5260 (5B4) , y Número ATCC PTA-5591 (3F8) , en el que dicho anticuerpo anti-GP88/PCDGF es capaz de detectar GP88 en una concentración tan baja como 0, 1 nanogramos por mililitro.

6. Un método según la reivindicación 1, donde dicha muestra es una muestra de suero.

7. Un kit para diagnosticar actividad tumorigénica en células mediante la medición de la concentración de PCDGF según el método de la reivindicación 1, que comprende un recipiente, y un anticuerpo de PCDGF anti-humano como se describe en la reivindicación 5 o un fragmento ligante de antígeno del mismo.

8. Un kit para determinar si un paciente está respondiendo o es sensible a terapia anti-tumorigénica mediante la medición de la concentración de PCDGF según el método de la reivindicación 1, que comprende un recipiente y anticuerpo de PCDGF anti-humano como se describe en la reivindicación 5 o un fragmento ligante de antígeno del mismo.