Método para determinar la sensibilidad o la resistencia de productos aislados de retrovirus a moléculas y kits de diagnóstico.

Un método de determinar la sensibilidad o la resistencia de los productos aislados de retrovirus VIH-1 a una molécula que comprende:

a) amplificar secuencias que codifican una proteasa de un retrovirus VIH-1 que se va a estudiar precedidas de los aminoácidos 6 del sitio de escisión y seguidas de al menos un aminoácido de otro sitio de escisión, en donde dichos sitios de escisión corresponden a los enlaces peptídicos específicos que enmarcan las secuencias primarias de la proteasa del VIH-1 en el precursor Gag-Pol que se hidrolizados para la liberación de dicha proteasa,

b) recombinar fragmentos de ADN, un producto final de la amplificación, y un vector de expresión que permite la expresión de la secuencia que codifica la proteasa del retrovirus VIH-1 que se va a estudiar precedida por los 6 aminoácidos del sitio de escisión y seguida de al menos un aminoácido de otro sitio de escisión bajo control de un promotor inducible conocido por medio de la co-transformación del vector y los fragmentos de ADN con al menos una célula de levadura,

c) cultivar la célula o células de levadura co-transformada para obtener un número suficiente de transformantes para llevar a cabo un ensayo de sensibilidad o resistencia, y recuperar los transformantes procedentes de la célula co-transformada, en cualquier medio adecuado,

d) incubar los transformantes en presencia de una molécula que se va a someter a ensayo,

e) analizar cualitativamente o cuantitativamente las células vivas, y

f) deducir el fenotipo de sensibilidad o resistencia.

Método para determinar la sensibilidad o la resistencia de productos aislados de retrovirus a moléculas y kits de diagnóstico

Solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes de los Estados Unidos con el Núm. de Ser. 12/503.174 y Núm. de Ser. 12/504.456 presentadas el 15 de Julio de 2009 y 16 de Julio de 2009.

Campo técnico

Esta descripción se refiere a métodos para determinar la sensibilidad o la resistencia de productos aislados de retrovirus a moléculas, a tratamientos retrovirales terapéuticos basados en inhibidores de proteasas virales, y a kits de diagnóstico derivados de la aplicación de los métodos.

Antecedentes Los agentes etiológicos del SIDA son los virus de la inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2. Estos virus, que comparten ciertas características clínicas y biológicas, tienen grandes diferencias, en particular con respecto a la forma en que en la que se infecta el anfitrión. De este modo, la infección por el VIH-2 es más difícil que por el VIH-1 (Ancelle R, O Bletr y , A C Baglin, F Brun-Vezinet, MA Rey y P Godeau, 1987, Long incubation period for HIV-2 infection. Lancet. 1:688-9; Marlink R, P Kandki, I Thior, K Travers, G Eisen, T Siby, I Traore, C C Hsieh, M C Dia and E H Gueye. 1994. Reduced rate of disease development after HIV-2 infection as compared to HIV-1. Science. 265:1587-90; Adjorlolo-Johnson G, K M De Cock, E Ekpini, K M Vetter, T Sibailly, K Brattegaard, D Yavo, R Doorly, J P Whitaker and L Kestens. 1994. Prospective comparison of mother-to-child transmission of HIV-1 and HIV-2 in Abidjan, Ivor y Coast. JAMA. 272:462-6; Marlink, R. 1996. Lessons from the second AIDS virus, HIV-2. AIDS. 10:68999.) , la carga viral en plasma de los individuos infectados por VIH-2 es menos elevada e inferior que la de los individuos infectados por VIH-1 (Andersson S, H Norrgren, Z da Silva, A Biague, S Bamba, S Kwok, C Christopherson, G Biberfeld, and J Albert. 2000. Plasma viral load in HIV-1 and HIV-2 singly and dually infected individuals in Guinea-Bissau, West Africa: significantly lower plasma virus set point in HIV-2 infection than in HIV-1 infection. Arch. Intern. Med. 160:3286-93; Popper S J, A D Sarr, K U Travers, A Gueye-Ndiaye, S Mboup, M E Essex, and P J Kanki. 1999. Lower human immunodeficiency virus (HIV) type 2 viral load reflects the difference in pathogenicity of HIV-1 and HIV-2. J Infect Dis. 180:1116-21.) , y los individuos infectados por VIH-2 desarrollan la enfermedad más lentamente (Vittinghoff E, S Scheer, P O'Malley, G Colfax, S D Holmberg and S P Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and recent declines in AIDS incidence and mortality. J Infect Dis. 179:71720; Blanco R, Carrasco, L, and Ventoso, I. 2003. Cell killing by HIV-1 protease. J. Biol. Chem. 278:1086-93; Liu H, Krizek J, and Bretscher A. 1992. Construction of a GAL1-regulated yeast cDNA expression librar y and its application to the identification of genes whose overexpression causes lethality in yeast. Genetics 132:665-673) .

El VIH-2 se identificó por primera vez en África Occidental en 1986 (Clavel F, D Guetard, F Brun-Vezinet, S Chamaret, M A Rey, M 0 Santos-Ferreira, A G Laurent, C Dauguet, C Katlama, and C Rouzioux. 1986. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 233:343-6) . En esta región, la prevalencia del VIH-2 varía entre 1% y 10% (Langley C L, E Benga-De, C W Critchlow, I Ndoye, M D Mbengue-Ly, J Kuypers, G Woto-Gaye, S Mboup, C Bergeron, K K Holmes, and N B Kiviat. 1996. HIV-1, HIV-2, human papillomavirus infection and cervical neoplasia in high-risk African women. AIDS. 10:413-7; Poulsen A G, B Kvinesdal, P Aaby, K Molbak, K Frederiksen, F Dias and E Lauritzen. 1989. Prevalence of and mortality from human immunodeficiency virus type 2 in Bissau, West Africa. Lancet. 1:827-31; Wilkins A, D Ricard, J Todd, H Whittle, F Dias, and A Paulo Da Silva 1993. The epidemiology of HIV infection in a rural area of Guinea-Bissau. AIDS. 7:1119-22) . La mayoría de los casos deinfección por el VIH-2, fuera de África Occidental, se encuentran en los países europeos y especialmente en Portugal, en donde los individuos infectados por el VIH-2 representan el 13% de la población infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana (Soriano V, P Gomes, W Heneine, A Holguin, M Doruana, R Antunes, K Mansinho, W M Switzer, C Araujo, V Shanmugam, H Lourenco, J Gonzalez-Lahoz and F Antunes. 2000. Human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) in Portugal: clinical spectrum, circulating subtypes, virus isolation, and plasma viral load. J. Med. Virol. 61:111-6) . En Francia, se ha estimado que 1% de la población infectada por el VIH está infectado por el virus de tipo 2.

En los países desarrollados, los individuos infectados por el VIH-1 y/o por el VIH-2 son tratados mediante terapia química, compuesta por moléculas que tienen una actividad inhibidora para una u otra de las dos enzimas virales: Transcriptasa Inversa y Proteasa.

Por otra parte, los individuos infectados por el VIH-1 y/o por el VIH-2 también son tratados mediante terapia química, compuesta por moléculas que tienen una actividad inhibidora del proceso de la entrada viral o de las enzimas virales: Transcriptasa Inversa, Proteasa, e Integrasa.

A pesar de que el tratamiento ha ayudado significativamente a reducir la morbilidad y la mortalidad causadas por la infección por el VIH (Palella FJ, Jr, KM Delaney, AC Moorman, MO Loveless, J Fuhrer, GA Satten, DJ Aschman y SD Holmberg. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators. N. Engl. J. Med. 338:853-60; Vittinghoff E, S Scheer, P O'Malley, G Colfax, S D Holmberg and S P Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and recent declines in AIDs incidence and mortality. J. Infect. Dis. 179:717-20) , Se han observado algunos casos de fracaso terapéutico.

La posibilidad de amplificar, a partir del plasma, ARN o ADN de las células de los individuos infectados por el VIH-1 y el fracaso terapéutico, ha hecho posible comprender a nivel molecular la ineficacia espontánea o progresiva de los tratamientos terapéuticos. La determinación, en particular, de la secuencia de ácido nucleico de las dos enzimas virales transcriptasa inversa y proteasa ha demostrado la aparición de un cierto número de mutaciones. Los resultados obtenidos durante los estudios in vitro en los que la cepa viral de tipo salvaje (y por lo tanto sensible a los tratamientos) que portaba las mutaciones han demostrado claramente la implicación de estas mutaciones en la resistencia del virus al tratamiento.

Los investigadores por lo tanto han realizado una cierta cantidad de trabajo sobre estas mutaciones y las resistencias que generan para orientar y guiar la elección del tratamiento terapéutico y optimizar su eficacia.

Se desarrollaron dos enfoques técnicos diferentes para orientar los tratamientos terapéuticos. Uno consistió en la búsqueda solo de las mutaciones ya conocidas dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas virales y se denomina enfoque de determinación del genotipo. El otro, que no necesita el conocimiento de la presencia de mutaciones resistentes dentro de las secuencias virales, consiste en el ensayo en un sistema basado en células la inhibición de la replicación viral en presencia de moléculas inhibidoras, y se denomina enfoque de determinación del fenotipo.

Desafortunadamente, las estrategias económicas de los laboratorios han conducido la mayoría de las veces a una falta general de interés en la comunidad científica en relación con el tratamiento de los pacientes infectados por el VIH-2 (siendo las poblaciones más afectadas por el VIH-2 principalmente las de los países en desarrollo) o han dado lugar a soluciones inadecuadas: tratamientos, pruebas y análisis que son demasiado caros, diagnósticos, por ejemplo, diagnósticos de determinación del fenotipo que son demasiado largos o imposibles de implementar en el lugar, ausencia de estructuras competentes en el país de que se trate, etc.

Por lo tanto, los resultados obtenidos en los diferentes estudios llevados a cabo sobre el VIH-2 no han sido lo suficientemente consistentes como para que sea posible formular una correlación entre una mutación particular de la proteasa del VIH-2, y un fenotipo de resistencia.

Cabe señalar que, la progresión de la enfermedad que es más lenta en los individuos infectados por el VIH-2 que en los infectados por el VIH-1, el recuento de células T CD4 y la determinación de la carga viral en plasma no toman en cuenta rápidamente la aparición de cepas resistentes en los pacientes en tratamiento.

Existen en la actualidad varias empresas que proporcionan el perfil... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinar la sensibilidad o la resistencia de los productos aislados de retrovirus VIH-1 a una molécula que comprende:

a) amplificar secuencias que codifican una proteasa de un retrovirus VIH-1 que se va a estudiar precedidas de los aminoácidos 6 del sitio de escisión y seguidas de al menos un aminoácido de otro sitio de escisión, en donde dichos sitios de escisión corresponden a los enlaces peptídicos específicos que enmarcan las secuencias primarias de la proteasa del VIH-1 en el precursor Gag-Pol que se hidrolizados para la liberación de dicha proteasa,

b) recombinar fragmentos de ADN, un producto final de la amplificación, y un vector de expresión que permite la expresión de la secuencia que codifica la proteasa del retrovirus VIH-1 que se va a estudiar precedida por los 6 aminoácidos del sitio de escisión y seguida de al menos un aminoácido de otro sitio de escisión bajo control de un promotor inducible conocido por medio de la co-transformación del vector y los fragmentos de ADN con al menos una célula de levadura,

c) cultivar la célula o células de levadura co-transformada para obtener un número suficiente de transformantes para llevar a cabo un ensayo de sensibilidad o resistencia, y recuperar los transformantes procedentes de la célula co-transformada, en cualquier medio adecuado,

d) incubar los transformantes en presencia de una molécula que se va a someter a ensayo,

e) analizar cualitativamente o cuantitativamente las células vivas, y

f) deducir el fenotipo de sensibilidad o resistencia.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método permite que las moléculas de ensayo tengan un efecto directo sobre la actividad de la proteasa hacia su sustrato natural que es el precursor de la proteasa de VIH-1.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde se elaboró una secuencia del precursor de VIH-1 mutada que contiene un nucleótido A adicional en la posición 1638 para imitar el Desplazamiento del Marco de Lectura Abierto natural de la transcripción del Gen Gag-Pol.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende antes de la etapa a) , extraer ácidos nucleicos de i) células infectadas por un retrovirus VIH-1 y/o ii) fluidos corporales de animales infectados, y/o iii) sangre de animales infectados, y/o iv) medios de cultivo de células infectadas.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el ácido nucleico es ADN y/o ARN.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los ácidos nucleicos se extraen de células tomadas de un individuo o de un animal infectados por un retrovirus VIH-1 y/o ii) fluidos corporales de animales infectados, y/o iii) sangre de animales infectados, y/o iv) medios de cultivo de células infectadas.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las moléculas son al menos una seleccionada del grupo que consiste en moléculas de una genoteca, moléculas químicas, moléculas naturales y moléculas extraídas de plantas.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las moléculas son al menos una seleccionada del grupo que consiste de moléculas químicas que tienen una actividad inhibidora de la proteasa viral, tratamientos terapéuticos basados en inhibidores de la proteasa viral.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la incubación se lleva a cabo con una concentración creciente de moléculas.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico se amplifica con un par de cebadores seleccionados del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 48, 51 a 58.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es uno cualquiera de los SEC ID NO: 9 a SEC ID NO: 37.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector de expresión es el plásmido pRS316-Gal 1/10.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el vector de expresión es el plásmido pRS316Gal1/10 que comprende el promotor inducible Gal1/10 en la posición 5' de un sitio de clonación de un gen que se va a expresar, y en donde un fragmento BamH1-Sac1 es remplazado por otro fragmento de ADN que consiste en (de 5' a 3') :

el sitio de restricción BamH1, único en el vector, seguido de aproximadamente 20 nucleótidos en una secuencia de retrovirus situada inmediatamente aguas arriba de la proteasa, seguido de un sitio de restricción, único en el vector, seguido de 0-2511 nucleótidos de la secuencia de retrovirus situado aguas abajo de la proteasa, seguido del sitio de restricción Sac1, único en el vector.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde los aproximadamente 20 nucleótidos de la secuencia de retrovirus VIH-1 están situados aguas arriba de la proteasa, seguido de un sitio de restricción XhoI.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de cultivo de las células de levadura co-transformadas es deficiente en glucosa.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la incubación del transformante se realiza en galactosa.

18. Un kit de diagnóstico que realiza el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende: cebadores de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 48, 51, 15 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58; al menos un vector de expresión;

al menos una cepa de levadura; y al menos una placa de múltiples pocillos u otro soporte.

19. El kit de diagnóstico según la reivindicación 18, en donde el vector de expresión es el plásmido 20 pRS316-Gal1/10.

20. El kit de diagnóstico según la reivindicación 18, en donde la levadura es Saccharomyces cerevisiae.