Derivados de glicosaminoglicanos totalmente N-desulfatados como agentes inhibidores de la heparanasa, dotados con actividad antiangiogénica y desprovistos de efecto anticoagulante.

Heparina N-reacetilada totalmente N-desulfatada, de fórmula (1)

en la que el anillo U tiene el siguiente significado

R y R1 son un residuo acetilo;

X y X', son el grupo -CH2-D, en el que D es hidroxilo;

n y m, que pueden ser los mismos o diferentes, pueden variar de 1 a 40; la suma de n+m varía de 6 a 40;la relación m:n varía de 10:2 a 1:1, el símbolo indica que las unidades marcadas con m y n estánestadísticamente distribuidas a lo largo de la cadena de polisacárido y no son necesariamentesecuenciales.

Derivados de glicosaminoglicanos totalmente N-desulfatados como agentes inhibidores de la heparanasa, dotados con actividad antiangiogénica y desprovistos de efecto anticoagulante La invención descrita en la presente memoria se refiere a heparinas totalmente-N-desulfatadas y N-Meacetiladas, a procedimientos para su preparación, a su uso como ingredientes activos para la preparación de medicamentos útiles en afecciones patológicas, como tumores, incluidas las formas metástaticas, y para cualquier indicación terapéutica que obtenga un beneficio de la inhibición de la heparanasa, y a composiciones terapéuticas que las contienen.

Estado de la técnica

Los estudios realizados en la Tumor Biological Research Unit del Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel (Isr. Med. Assoc. J. 2000, 2, 37-45; J. Med. Chem. 2000, 43, 2591-600; Invasion Metastasis 1994-95, 14, 290-302; Exp. Cell Res. 1992, 201, 208-15;) se centran en la implicación de los factores de crecimiento que se enlazan a la heparina, el sulfato de heparano y las enzimas que degradan al sulfato de heparano (heparanasa) en la angiogénesis y la metástasis tumoral. Estos estudios han sido aplicados a la exploración y a la identificación de derivados de la heparina y moléculas miméticas de la heparina/sulfato de heparano con potente actividad inhibidora de la heparanasa (Nature Med. 1999, 5, 735-6; Science, 1999, 285, 33-4) .

Las células tumorales liberan la enzima heparanasa, una endo-β-D-glucuronidasa que degrada la cadena de polisacárido de los proteoglicanos tipo sulfato de heparano en la superficie celular y en la matriz extracelular.

La implicación de la heparanasa en la angiogénesis tumoral ha sido correlacionada con la capacidad de liberar bFGF (FGF-2) y otros factores de crecimiento de su almacén dentro de la ECM (matriz extracelular) . Estos factores de crecimiento proporcionan un mecanismo para la inducción de la neovascularización en situaciones normales y patológicas.

La heparanasa puede así facilitar no solo la invasión de células tumorales y la metástasis sino también la angiogénesis tumoral, ambas etapas críticas en la progresión de los tumores.

Los agentes inhibidores específicos de la enzima heparanasa impiden la liberación y la activación de los factores de crecimiento almacenados por el sulfato de heparano así como la ruptura de la ECM, y son considerados como un enfoque muy prometedor para desarrollar fármacos anticancerígenos.

Por tanto, uno de los posibles enfoques terapéuticos para un fármaco antiangiogénico es el desarrollo de un agente inhibidor potente y selectivo de la heparanasa.

Para una discusión sobre la angiogénesis puede hacerse referencia al documento WO 01/55221, a nombre del presente solicitante.

Otra importante implicación de la heparanasa es tanto la inflamación como la autoinmunidad. De hecho, la actividad de la heparanasa también se correlaciona con la capacidad de las células activadas del sistema inmunológico para dejar la circulación y provocar respuestas tanto inflamatorias como autoinmunes. La interacción de las plaquetas, granulocitos, linfocitos T y B, macrófagos y mastocitos con la ECM subendotelial está asociada con la degradación del sulfato de heparano mediante la actividad de la heparanasa. La enzima es liberada desde compartimentos intracelulares (es decir, lisosomas, gránulos específicos) en respuesta a varias señales de activación, lo que sugiere su implicación y presencia regulada en sitios inflamatorios y en lesiones autoinmunes. El tratamiento de animales experimentales con agentes inhibidores de la heparanasa (es decir, especies no anticoagulantes de heparina de bajo peso molecular - LMWH) redujo notablemente la incidencia de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , artritis adyuvante y rechazo a los injertos en animales experimentales, lo que indica que pueden aplicarse inhibidores de la heparanasa para inhibir enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Heparina La heparina es una mezcla heterogénea de polisacáridos que se encuentran en la naturaleza de varias longitudes y varios grados de sulfatación, la cual posee actividad anticoagulante y es secretada por los mastocitos del tejido conjuntivo en el hígado (en el que fue aislada por primera vez) , en los músculos, pulmones, timo y bazo.

Además de la secuencia regular, en la heparina se ha identificado una secuencia correspondiente al sitio activo de la actividad antitrombina.

La actividad antitumoral y antimetastásica de la heparina y sus derivados es debida a su capacidad de inhibir la heparanasa, de bloquear los factores de crecimiento y de regular la angiogénesis.

Sulfatos de heparano (HS)

Los sulfatos de heparano (HS) son ligandos de proteínas ubicuas. Las proteínas se enlazan a las cadenas de HS para una variedad de acciones desde la simple inmovilización o la protección contra la acción de degradación proteolítica a modulaciones específicas de actividades biológicas, tales como la angiogénesis.

El esqueleto carbohidrato, tanto en la heparina como en los sulfatos de heparano (HS) , consiste en una alternancia de D-glucosamina (GlcN) y ácidos hexurónicos (G1cA o IdoA) .

En la heparina, los residuos GlcN están principalmente N-sulfatados, mientras que en los HS están tanto Nsulfatados como N-acetilados, con una pequeña cantidad de grupos NH2 sin sustituir.

En promedio, los HS están también menos O-sulfatados que la heparina.

El uso de heparina en el tratamiento de trastornos de angiogénesis, tales como tumores, particularmente metástasis, está sustancialmente limitado por la actividad anticoagulante de la heparina.

Se han hecho modificaciones químicas a la heparina para reducir su capacidad anticoagulante, preservando al mismo tiempo sus propiedades antitumorales.

La apertura de una unidad de ácido glucurónico en el sitio antitrombina reduce la afinidad de la heparina por la antitrombina: de esta forma, pueden usarse heparinas con efectos anticoagulantes aminorados, pero que aún retienen propiedades antiangiogénicas.

Heparanasas Las heparanasas son enzimas que pertenecen a una familia de endoglicosidasas (una endo-β-D-glucuronidasa)

que hidrolizan los enlaces glicosídicos internos de las cadenas de sulfatos de heparano (HS) y heparina.

Estas endoglicosidasas están implicadas en la proliferación de células tumorales, en metástasis y en la neovascularization de tumores. Estas enzimas son dianas biológicas para la actividad antiangiogénica. En la bibliografía científica hay un gran número de estudios de correlación estructura/actividad (véase, por ejemplo, Lapierre F. et al., Glycobiology, vol. 6, (3) , 355-366, 1996) . Aunque muchos aspectos tienen aún que ser clarificados, se ha informado de estudios con respecto a la inhibición de las heparanasas por la heparina y sus derivados, usando ensayos específicos que han llevado a que emerjan consideraciones de tipo estructural, las cuales pueden servir como guías para obtener nuevos, más selectivos, derivados.

En el trabajo anteriormente mencionado de Lapierre et al., se describen derivados de la heparina que se obtienen por 2-O desulfatación o por “escisión a glicol” (oxidación con per y odato y subsiguiente reducción con borohidruro de sodio) . Estos derivados, definidos en la presente memoria como "heparina 2-O-desulfatada" y "RO-heparina", respectivamente, han mantenido parcialmente la actividad antiangiogénica de la heparina como se evaluó por medio del ensayo CAM en presencia de corticosteroides (ibid. página 360) .

Se ha informado que los N-acil derivados de la heparina, que son moléculas miméticas de sulfato de heparano más próximas que la heparina, inhiben a la heparanasa sólo algo menos que los N-sulfato derivados. (Irimira T., Biochemistr y 1986, 25, 5322-5328; Ishai- Michaeli R., et al, Biochemistr y 1992, 31, 2080-2088) .

Heparinas y FGF

Los FGFs regulan múltiples procesos biológicos tales como el crecimiento y la diferenciación celular, pero también 35 funciones implicadas en procesos patológicos tales como la angiogénesis tumoral.

Los FGFs son factores de crecimiento (una familia de más que 10 polipéptidos, de los cuales los FGFs ácido (FGF1) y básico (FGF-2) son los que han sido más estudiados, los cuales requieren un cofactor polisacárido, heparina o HS, para enlazarse al receptor de FGF (FGFR) y activarlo.

Aunque el mecanismo preciso mediante el cual la heparina y los HS activan a los FGFs es desconocido, sin 40 embargo se sabe que la heparina/FGF/FGFR forman un complejo "trimolecular" o "ternario".

Un mecanismo postulado es que la heparina y los HS inducen la llamada dimerización... [Seguir leyendo]

1. Heparina N-reacetilada totalmente N-desulfatada, de fórmula (1)

en la que el anillo U tiene el siguiente significado R y R1 son un residuo acetilo;

X y X’, son el grupo -CH2-D, en el que D es hidroxilo;

n y m, que pueden ser los mismos o diferentes, pueden variar de 1 a 40; la suma de n+m varía de 6 a 40; la relación m:n varía de 10:2 a 1:1, el símbolo indica que las unidades marcadas con m y n están estadísticamente distribuidas a lo largo de la cadena de polisacárido y no son necesariamente secuenciales.

2. Procedimiento para la preparación de los compuestos según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a) N-desulfatación mediante hidrólisis solvolítica de residuos de sulfamino en DMSO:H2O 95:5 v:v a temperatura ambiente durante un tiempo que varía de 0, 5 a 8 h, para dar la eliminación total de grupos sulfato en la posición 2 de los residuos de glucosamina;

b) N-acetilación de dichos grupos totalmente desulfatados en la posición 2 de los residuos de glucosamina mediante tratamiento en una disolución acuosa alcalina (pH 8-9) con un agente acilante, para dar grupos totalmente acilados en la posición 2 de los residuos de glucosamina;

c) oxidación de los dioles con per y odato de sodio, para dar la apertura del anillo glicósido y la formación de dos grupos aldehído por residuo modificado; y,

d) reducción de dichos grupos aldehído a alcoholes primarios;

e) hidrólisis ácida opcional de los compuestos obtenidos en la etapa d) para obtener oligosacáridos correspondientes a las secuencias regulares; o alternativamente f) someter los productos obtenidos en la etapa d) a hidrólisis enzimática parcial con una enzima seleccionada del grupo que consiste en liasa, heparinasa, heparitinasa, o equivalente, para dar oligosacáridos, preferiblemente tetra- u octa-sacáridos, consistiendo el residuo terminal no reducido en ácido idurónico insaturado, el residuo reducido en una N-sulfoglucosamina y conteniendo al menos un residuo de ácido idurónico abierto.

3. Uso de los compuestos según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento que tiene actividad inhibidora de la heparanasa.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho medicamento tiene actividad antiangiogénica.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de la inflamación.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que la enfermedad a tratar se selecciona del grupo que consiste en tumores primarios, metástasis, retinopatías diabéticas, psoriasis, fibroplasia retrolenticular, 5 restenosis después de una angioplastia, baipás coronario, inflamación, artritis, enfermedades autoinmunes, rechazo de aloinjertos, enfermedades cardiovasculares, enfermedad fibro-proliferativa, enfermedades provocadas por la agregación anormal de las plaquetas, enfermedades provocadas por la proliferación del músculo liso, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis aguda, hipertensión pulmonar neonatal, asma, fallo cardiaco congestivo, hipertensión pulmonar del adulto, hipertensión renovascular, retinopatías proliferativas, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, diabetes dependiente de la insulina, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn.

8. Composición terapéutica, que al menos contiene un compuesto según la reivindicación 1 como un ingrediente activo en mezcla con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.