Procedimiento de obtención de heparinas de bajo y muy bajo peso molecular.

Procedimiento de obtención de heparinas de bajo y muy bajo peso molecular.

La presente invención se refiere al procedimiento de preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y de muy bajo peso molecular (HMBPM) que comprende las etapas de transalificación de heparina en heparinato de benzalconio; despolimerización en medio orgánico y transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo. La presente invención también se refiere a un producto obtenido a través del procedimiento descrito en la presente invención.

Procedimiento de obtención de heparinas de bajo y muy bajo peso molecular

OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al procedimiento de preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y de muy bajo peso molecular (HMBPM) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La heparina es un polisacárido de la familia de los glicosaminoglicanos, formado por ácido urónico (ácido Lidurónico o D-glucurónico) y D-glucosamina, unidos de forma alternada. El ácido L-idurónico puede estar 2-Osulfatado y la D-glucosamina, puede estar N-sulfatada y/o 6-O-sulfatada, y en menor extensión N-acetilada o 3O-sulfatada (Mapping and quantifi-cation of the major oligosaccharides component of heparin. Linhardt RJ, Rice KG, Kim YS et al. Biochem J 1988; 254 :781-787) . La heparina se usa preferentemente como sal sódica, pero también puede usarse como sal de otros metales alcalinos o alcalinotérreos y se utiliza principalmente como medicamento antitrombótico y anticoagulante (Anticoagulant therapy for major arterial and venous thromboembolism. Tran HAM, Ginsberg JS. Basic principles and clinical practice. Colman RW, Marder VJ, Clowes AW, George JN, Goldhaber SZ (Ed) . Lippincott Williams and Wilkins; 2006:1673-1688) .

Las heparinas se pueden clasificar en función de su peso molecular en, heparina no fraccionada (HNF) , heparina de bajo peso molecular (HBPM) y heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM) . Las HBPM y HMBPM provienen de la despolimerización de la molécula original de HNF.

La acción antitrombótica de las HBPM, como ocurre en el resto de las heparinas, necesita la presencia de la antitrombina III (ATIII) . La heparina se une a la antitrombina mediante una secuencia pentasacarídica específica, formando un complejo ternario HBPM-ATIII-Factor Xa. Se conoce a esta inhibición como acción antitrombótica. Por el contrario, en la acción anticoagulante, la neutralización de la trombina requiere la formación de un complejo ternario, HBPM-ATIII-Factor IIa, para lo que se necesitan al menos 18 sacáridos.

La mejora en las HBPM con respecto a la heparina sódica son debidas en gran medida al enriquecimiento en el sitio activante de la ATIII de las primeras con respecto a la segunda.

De otra parte, en la Heparina no fraccionada así como en las diversas HBPM ó HMBPM obtenidas por los métodos conocidos de despolimerización (enzimática, ácido nitroso, β-eliminación, etc.) , existe una medida que nos permite la determinación de la cantidad de pentasacárido dentro de la estructura general a través de la cuantificación del contenido de una unidad disacarídica específica y exclusiva del pentasacárido, correspondiente a Ácido D-Glucurónico (G) enlazado a N-sulfo-3-O-sulfo-D-Glucosamina (ANS, 3S) . Esta medida nos permite obtener una buena correlación entre el porcentaje presente de éste disacárido y el contenido de pentasacárido en la estructura heparínica y por tanto de actividad anti-FXa de la heparina en cuestión (Low molecular weight heparins: structural differentiation by bidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Guerrini M, Guglieri S, Naggi A, Sasisekharam R and Torri G. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2007; 33: 478-487) .

En el estado de la técnica se han descrito varios métodos para la preparación de HBPM. En el documento patente EP01955436 se describe un proceso de obtención de HBPM mediante un procedimiento que comprende las etapas de transalificación de una sal de heparina en heparinato de bencetonio, esterificación del heparinato de bencetonio con cloruro de bencilo, purificación y obtención de la sal sódica del éster bencílico de la heparina, transalificación de la sal del éster bencílico de heparina en sal de bencetonio, despolimerización con una base fuerte en medio orgánico, saponificación del éster y, si es necesario, purificación del producto. En esta invención es necesaria la formación previa de un intermedio éster bencílico de heparina del que a su vez hay que generar su heparinato de amonio cuaternario correspondiente, que es el sustrato donde actúa la base. En la presente invención el procedimiento descrito es más simple, eliminando la necesidad de preparar el intermedio éster bencílico con el lógico ahorro tanto en costes como en tiempos en el proceso.

El documento patente EP1070503 describe un procedimiento para la obtención de heparinas de bajo peso molecular con las siguientes características peso molecular medio: 2000 – 4000 Daltons, actividad anti-FXa entre 100 y 150 UI/mg, actividad anti-FIIa menor o igual de 10 UI/mg. Estas HBPM se obtienen mediante tratamiento del heparinato de benzalconio con base en medio no acuoso, que consta de las siguientes etapas: transalificación de heparina sódica en heparinato de benzalconio, primera despolimerización con base en medio orgánico, transalificación de la sal de benzalconio en sal sódica, formación de la sal de benzalconio del intermedio obtenido tras la primera despolimerización, segunda despolimerización con base en medio orgánico, transalificación de la sal de benzalconio en sal sódica y purificación final.

Por último en el documento patente ES2003197 se describe el mismo procedimiento que en el documento patente EP1070503 antes comentado salvo que la sal que se forma es un heparinato de bencetonio. La base

que se utiliza en este procedimiento es el Triton B, hidróxido de amonio cuaternario y en el documento se describe que puede ser utilizada cualquier hidróxido de amonio cuaternario, no dando ninguna enseñanza de cómo puede influir la base en este procedimiento y explicando que no es un elemento decisivo al poderse utilizar cualquiera.

Por lo tanto por lo que se conoce en el estado de la técnica, se deriva que puede ser de un gran interés para la industria desarrollar un procedimiento eficiente alternativo para la preparación de HBPM y HMBPM que provea de un procedimiento que respete al máximo la secuencia pentasacáridica específica ATIII y que consiga eliminar etapas como la esterificación del heparinato de bencetonio con cloruro de bencilo, transalificación de la sal del éster bencílico de heparina en sal de bencetonio, y saponificación posterior de dicho éster.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado un nuevo procedimiento de obtención de HBPM y HMBPM de alto rendimiento y alta regioselectividad, lo que redunda en un proceso más selectivo. Además el procedimiento de la invención es más simple que otros procedimientos conocidos.

Los inventores han comprobado, que en los procesos de hemisíntesis de HBPM y HMBPM por mecanismos de ß-eliminación la utilización específicamente como sustrato para la despolimerización de heparinato de benzalconio, confiere a la acción de bases fuertes y estéricamente impedidas la capacidad de preservar el pentasacárido activante de la ATIII, ya que este pentasacárido presenta en su estructura un monosacárido trisulfatado y por tanto estéricamente más impedido que otras posibles posiciones de rotura de la molécula que presentan monosacáridos con menor grado de sulfatación.

El procedimiento se caracteriza por una primera etapa de transalificación, es decir de una reacción de reconversión de una sal en otra sal, una despolimerización con una base fosfaceno o una base derivada de la guanidina y una última transalificación.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de las composiciones de la invención que comprenden las etapas de: a) transalificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio, b) despolimerización en medio orgánico con la adición de una base fosfaceno o una base derivada de la guanidina; y c) transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Se complementa la presente memoria descriptiva, con un juego de figuras, ilustrativas del ejemplo preferente y nunca limitativo de la invención.

Figura 1: Representación de la región de las señales anoméricas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC del producto descrito en el ejemplo 4 despolimerizado con Triton B, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O) . En el espectro podemos observar cinco picos de correlación que corresponden a los cinco monosacáridos que componen el pentasacárido. ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; I2S, ácido L-idurónico 2-sulfato; ANS, 3S, N-sulfo-3-O-sulfo-D-glucosamina; G- (ANS, 3S) , ácido D-glucurónico que precede a la unidad ANS, 3S y ANS- (G) , N-sulfo-D-glucosamina que precede al anillo de ácido D-glucurónico. El pico de correlación H1-C1 de la unidad G- (ANS, 3S) se ha resaltado con un círculo porque es la señal... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de las composiciones de HMBPM y/o HBPM caracterizado porque comprende las etapas de:

a) transalificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio; b) despolimerización en medio orgánico con la adición de una base fosfaceno o una base derivada de la guanidina; y c) transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo.

2. Procedimiento de obtención según reivindicación 1 caracterizado porque entre la etapa b) y la etapa c) se trata el producto obtenido en la etapa b) con peróxido de hidrógeno.

3. Procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizada porque el producto obtenido tras la etapa c) se purifica. 15

4. Procedimiento de obtención según reivindicación 3 caracterizada porque el producto obtenido tras la etapa c) se purifica mediante disolución en agua a una concentración comprendida entre el 7, 5 y 12, 5 % (p/v) , ajuste de pH entre un valor comprendido entre el 6, 5 y 7, 25, adición de cloruro de sodio a una concentración comprendida entre el 5 y 10 % (p/v) y precipitación con metanol.

5. Procedimiento de obtención según reivindicación 1-4 caracterizado porque la etapa de despolimerización se realiza en diclorometano, a una temperatura comprendida entre 20ºC y 40 ºC.

6. Procedimiento de obtención según reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa b) la relación peso: 25 volumen entre el heparinato de benzalconio y la base para cada adición, está entre 1:0, 5 y 1:0, 05.

7. Procedimiento de obtención según reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa b) la relación peso: volumen entre el heparinato de benzalconio y la base para cada adición, está entre 1:0, 3 y 1:0, 1.

8. Procedimiento de obtención según reivindicación 2 caracterizado porque en la etapa c) la relación peso: volumen entre el heparinato de benzalconio y el peróxido de hidrógeno está entre 1:1 y 1:0, 01.

9. Procedimiento de obtención según reivindicación 2 caracterizado porque en la etapa c) la relación peso:

volumen entre el heparinato de benzalconio y el peróxido de hidrógeno está entre 1:0, 2 y 1:0, 05. 35

10. Un producto obtenido a través del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 9.

95.0

95.0

100.0100.0

105.0 105.0

ppm (t2) 6.006.00 ppm (t2) 5.505.50 5.005.00 4.50 110.0 ppm (t1) 4.50 110.0 ppm (t1)

FIG. 1

95.095.0

100.0100.0

105.0

105.0

110.0

110.0ppm (t1)

ppm (t1)

6.006.00 5.505.50 5.005.00 4.504.50

ppm (t2) ppm (t2)

FIG. 2