Procedimiento multietapa para la despolimerización física de heparina en el que la heparina se somete a al menosdos irradiaciones con rayos γ

y en el que entre dos etapas de irradiación la heparina despolimerizada se somete auna etapa de separación y solo una fracción de la heparina despolimerizada obtenida de la primera irradiación sesomete a la segunda etapa de irradiación.

Procedimiento multietapa para la despolimerización física de heparina y productos obtenidos a partir de la misma

5 Estado de la técnica

La heparina es un polisacárido altamente sulfatado, polidisperso, heterogéneo, que pertenece a la familia de los glicosaminoglicanos, constituido por unidades de repetición disacárido con enlace 1!4, que consisten en αD-glucosamina (A) y un ácido hexurónico, ácido α-L-idurónico (I) o β-D-glucurónico (G) , con grupos O-sulfato en 10 diferentes posiciones de la unidad disacárido, especialmente en la posición 2 del idurónico (I2S) y la posición 3 y 6 de la glucosamina (A3s; A6S) , y grupos N-sulfato o N-acetilo en la posición 2 del residuo de glucosamina (ANS; ANAc) . La secuencia de repetición del disacárido que aparece más frecuentemente es !4) -α-L-ácido idurónico-2-O-sulfato (1!4) -α-D-glucosamina-N, 6-disulfato (1 ! (I2S-ANS, 6S) , que representa el segmento altamente sulfatado de heparina, localizado más cerca del extremo no reductor de la cadena de heparina. Las secuencias sub-sulfatadas, 15 representadas por I y G y ANAc no sulfatados están localizadas predominantemente hacia el extremo reductor del polímero. Aproximadamente un tercio de las cadenas de heparina contienen una secuencia de pentasacárido específica, caracterizada por un residuo ANS, 6S central que lleva un grupo sulfato extra en la posición 3 (ANS, 3S, 6S) , que constituye el sitio activo para la antitrombina III (AT) . Muchos modelos bioquímicos, así como estudios estructurales, sugieren que tal pentasacárido está localizado entre los dominios altamente y sub-sulfatados. Una

secuencia minoritaria, que implica residuos neutros como galactosa y xilosa, y correspondiente al extremo reductor de la cadena de polisacárido, es la región de unión (LR) a la proteína núcleo del proteoglicano.

El gran número de posibles variantes estructurales de las secuencias de heparina representa el amplio intervalo de actividades biológicas que la heparina promueve uniéndose a diferentes proteínas del plasma y 25 tisulares, tales como inhibidores de proteasa de la cascada de coagulación de la sangre, factores de crecimiento, quimiocinas, proteínas matriciales adhesivas, etc. (Capila, & Linhardt, 2002) . La identificación de las estructuras de heparina específicas responsables de la unión a los diversos ligandos de proteína supone un interés cada vez mayor. Aunque algunas proteínas, como AT, tienen afinidad solo por las irregularidades únicas de la estructura de la heparina, otras reconocen las regiones más regulares de la heparina, aunque este hecho no excluye la selectividad

de unión (Maccarana, Casu, & Lindahl, 1993) .

Dependiendo de su tamaño y disposición estructural, los oligosacáridos derivados de heparina pueden suscitar o inhibir efectos biológicos específicos. Típicamente, las secuencias de heparina con una longitud que varía de tetra a decasacáridos son responsables de la modulación de la actividad biológica de las proteínas.

Se ha demostrado recientemente que diferentes derivados de heparina de bajo y ultrabajo peso molecular, que varían de 1900 a 4600 Va, cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) en ratas después de la administración oral

o intravenosa, y que ejercen un efecto neuroprotector, potencialmente aprovechable en el tratamiento terapéutico de trastornos neurodegenerativos. Actualmente no está claro qué fracción de peso molecular de estos compuestos

heterogéneos cruza la BBB, y tampoco qué requisito estructural está relacionado con la acción biológica en el cerebro. La heterogeneidad estructural de la heparina influye en gran medida la estructura de los oligosacáridos correspondientes. Además, cada reacción de despolimerización usada para su preparación presenta su propia selectividad preferente, respecto a secuencias y/o residuos, y también normalmente modifica al menos el monosacárido en el sitio de escisión, generando diversidades estructurales adicionales.

45 [0005] El documento US 4.987.222 desvela un método para la despolimerización de heparina mediante el uso de rayos γ. Los ejemplos desvelan la preparación de heparina con un peso molecular promedio en peso (Pm) de aproximadamente 5.000 Da y con un alto contenido de S. La patente muestra una relación directa entre la cantidad de radiación y la reducción en el Pm. Sin embargo, el uso de radiación de acuerdo con el documento US 4.987.222

50 hace posible solo una reducción limitada en el Pm de heparina. Una vez se supera un cierto valor de radiación, el color se oscurece.

La degradación de heparina por rayos γ se reduce en gran medida cuando se irradia heparina en presencia de un compuesto orgánico, como enseña el documento WO 03/O76474. La heparina despolimerizada obtenida es 55 de color claro y no requiere procedimientos de decoloración.

Sorprendentemente, se ha encontrado que combinando al menos dos procedimientos de irradiación por rayos γ con procedimientos de separación, es posible obtener oligosacáridos derivados de heparina que tienen propiedades únicas.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento multietapa para la despolimerización física de heparina caracterizado por el uso de al menos dos etapas de irradiación con rayos γ en el que se realiza una etapa de 65 separación entre dos etapas de irradiación y solo una fracción de la heparina despolimerizada se somete a la etapa

de irradiación posterior.

También se refiere a diversos tipos de oligosacáridos derivados de heparina (HO) que pueden obtenerse mediante este procedimiento. 5

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento multietapa para la despolimerización física de heparina, en el que la heparina se somete a al menos dos irradiaciones con rayos γ y en el que entre dos etapas de

irradiación la heparina despolimerizada se somete a una etapa de separación. Sólo una fracción de la heparina despolimerizada se somete a la siguiente etapa de irradiación.

El procedimiento puede repetirse de nuevo hasta un total de 3 o más etapas de irradiación.

[0012] La etapa de separación puede ser cualquier etapa de separación conocida en la técnica, por ejemplo cromatografía de permeación en gel, que separa las diferentes fracciones por peso molecular, cromatografía de intercambio de iones, que separa las fracciones por densidad de carga, ultrafiltración y precipitación usando iones mono o divalentes.

[0013] Preferentemente, entre dos etapas de irradiación, se usa una cromatografía de permeación en gel y la fracción sometida a irradiación adicional es la fracción de alto peso molecular. Después de la última etapa de irradiación, es posible usar cromatografía de permeación en gel y/o cromatografía de intercambio de iones.

Preferentemente, el procedimiento multietapa de acuerdo con la invención comprende las siguientes

etapas: someter una solución de heparina a una primera etapa de despolimerización por rayos γ; someter los oligosacáridos derivados de heparina obtenidos a separación por cromatografía de permeación en gel, para aislar una fracción de alto peso molecular; someter la fracción de alto peso molecular a un segundo tratamiento por rayos γ; someter los oligosacáridos derivados de heparina obtenidos a una separación por cromatografía de permeación en gel para aislar una fracción que tiene un Pm comprendido entre 1.300 y 3.000 Da, preferentemente entre 1.800 y

2.800 Da. Más preferentemente, el procedimiento de acuerdo con la invención comprende adicionalmente una tercera etapa de irradiación y separación, más preferentemente comprende también una cuarta etapa de irradiación y separación.

En una realización adicional, la invención se refiere a una diversidad de fracciones HO que pueden

obtenerse de acuerdo con el procedimiento de la invención y que son útiles como un producto con actividad farmacológica potencial, o como un intermedio en la preparación de un compuesto farmacológico activo.

Una fracción obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención está caracterizada por un Pm comprendido entre 1.200 y 3.000 Da, preferentemente entre 1.800 y... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento multietapa para la despolimerización física de heparina en el que la heparina se somete a al menos dos irradiaciones con rayos γ y en el que entre dos etapas de irradiación la heparina despolimerizada se somete a

una etapa de separación y solo una fracción de la heparina despolimerizada obtenida de la primera irradiación se somete a la segunda etapa de irradiación.

2. Procedimiento multietapa de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

someter una solución de heparina a una primera etapa de despolimerización por rayos γ; someter los oligosacáridos derivados de heparina obtenidos a separación por cromatografía de permeación en gel, para aislar una fracción de alto peso molecular; someter la fracción de alto peso molecular a un segundo tratamiento con rayos γ; someter los oligosacáridos derivados de heparina obtenidos a separación por cromatografía de permeación en

gel para aislar una fracción que tiene un Pm comprendido entre 1.200 y 3.000 Da, preferentemente entre 1.800 y 2.800 Da.

3. Procedimiento multietapa de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende adicionalmente una tercera etapa de

irradiación y separación. 20

4. Procedimiento multietapa de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende adicionalmente una cuarta etapa de irradiación y separación.

5. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 2-4 en el que la fracción de oligosacáridos derivados de

heparina que tienen un Pm comprendido entre 1.800 y 2.800 Da obtenida después de la última cromatografía de permeación en gel se somete adicionalmente a cromatografía de intercambio iónico, para aislar fracciones que tienen diferente densidad de carga.

6. Procedimiento multietapa de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 en el que la irradiación con rayos γ se realiza en

presencia de un compuesto orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes, éteres, aldehídos, amidas y ácido fórmico.

7. Procedimiento multietapa de acuerdo con la reivindicación 6 en el que el compuesto orgánico es isopropanol y se

usa en una concentración del 0, 1 al 5% (v/v) . 35

8. Procedimiento multietapa de acuerdo con las reivindicaciones 1-7 en el que en cada etapa de despolimerización se da una dosis de radiación comprendida entre 50 y 300 kGy.

9. Procedimiento multietapa de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 en el que la fracción de oligosacáridos de 40 heparina despolimerizada sometida a la siguiente etapa de irradiación tiene un Pm > 3.500 D.

10. Heparina despolimerizada que tiene un Pm comprendido entre 1.200 y 3.000 Da y una concentración de ácido βD-glucurónico según se mide por RMN-1H igual a o menor de 19 %.

45 11. Heparina despolimerizada que tiene un contenido en N-acetil glucosamina igual a o mayor de 20%, preferentemente igual a o mayor de 22%, un Pm comprendido entre 3.500 y 10.000 Da, y un contenido de ANS, 3S, 6S mayor de 4 %.

12. Heparina despolimerizada que tiene un contenido de ANS, 3S, 6S mayor de 8% y un Pm comprendido entre 1.200 y

50 3.000 Da.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción