Heparán sulfato que se une a BMP2.

1. Una composición de heparán sulfato aislada o purificada en la que el componente de heparán sulfato es al menos 97 % de heparán sulfato HS/BMP2 que puede unirse específicamente a la SEC ID Nº:

1 o 6, o a la BMP2, en la que después de la digestión con heparín liasas (heparinasa, heparitinasa I y II) hasta el final y después de someter los fragmentos de disacárido resultantes a HPLC de intercambio aniónico fuerte (SAX-HPLC), el heparán sulfato HS/BMP2 tiene una composición de disacáridos que comprende:

UA-GlcN 8,2 % (± 3 %);

UA-GlcNAc 17,5 % (± 3 %);

UA-GlcN,6S 3,7 % (± 3 %);

UA,2S-GlcN 4,5 % (± 3 %);

UA-GlcNS 16,2 % (± 3 %);

UA,2S-GlcNS,6S 0,5 % (± 3 %);

en la que la digestión se realiza disolviendo una muestra de HS/BMP2 (100 μg) en acetato sódico 100 mM / acetato cálcico 0,2 M (pH 7,0); digiriendo secuencialmente la muestra con heparinasa (10 mU/ml) a 37 ºC durante 2 horas, seguido de heparitinasa I (10 mU/ml) a 37 ºC durante 1 hora, seguido de heparitinasa II (10 mU/ml) a 37 ºC durante 18 horas, seguido de una alícuota de cada dicha liasa a 37 ºC durante 6 horas, en la que después de la digestión las muestras se procesan en una columna de BioGel P-2 (1 x 120 cm) equilibrada con NH4HCO3 0,25 M, en la que el pico que comprende los disacáridos se liofiliza y después se disuelve en el agua acidificada (pH 3,5 con HCl) y después se hace pasar sobre una columna ProPac PA-1 de SAX-HPLC, en la que los disacáridos se eluyen con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1,0 M (pH, 3,5) durante 60 minutos a un caudal de 1 ml/min.

Heparán sulfato que se une a BMP2 Campo de la invención

La presente invención se refiere a glucosamianoglucanos que pueden unirse a BMP2, incluyendo su aislamiento e identificación, y al uso de los glucosaminoglucanos aislados en el crecimiento y/o desarrollo de tejido.

Antecedentes de la invención

Los glucosaminoglucanos (GAG) son macromoléculas complejas de hidratos de carbono responsables de realizar y regular una inmensa cantidad de funciones celulares esenciales.

Los GAG se han implicado en la modulación o mediación de muchos sistemas de señalización junto con los muchos cientos de factores adhesivos y de crecimiento de unión a heparina conocidos. Se contempla que la asociación de factores de crecimiento con los GAG modula sus diversas actividades con una diversa serie de acciones, tales como la prolongación de sus semividas protegiéndolas de la degradación proteolítica, modulando la localización de estas citocinas en la superficie celular, mediando interacciones moleculares y estableciendo complejos de ligando- receptor.

Hay un número cada vez mayor de factores de crecimiento de unión a heparina identificados, añadido a los cientos ya conocidos, la mayoría de los cuales se purificaron por cromatografía de afinidad con heparina. Éstos incluyen la gran familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), los PDGF, las pleiotrofinas dentro de la superfamilia de citocinas TGF-(5. Esta última familia de factores incluye la subfamilia de la proteína morfogenética ósea (BMP) osteoinductora, denominada así por su capacidad para inducir la formación de hueso ectópico.

La naturaleza y el efecto de la interacción de los GAG y los factores de crecimiento siguen sin aclararse. Aunque se ha demostrado que la interacción entre el FGF2 y las secuencias de sacáridos particulares encontradas en la heparina es de alta afinidad, generalmente sigue sin aclararse si la asociación, entre otros factores de crecimiento y los heparanos, implica una alta afinidad o interacción de unión específica entre una secuencia de aminoácidos o un epítopo conformacional en el factor de crecimiento de la proteína y una secuencia de sacáridos incorporada en el GAG, o si la asociación está mediada por interacciones inespecífica, de afinidad más baja, entre el GAC y el factor de crecimiento de proteínas.

Si las interacciones entre los GAG y las proteínas que residen, o que se secretan, en la matriz extracelular son específicas, los compañeros de unión deben identificarse para desenmarañar las interacciones y comprender cómo estas interacciones pueden usarse o modularse que para proporcionar nuevos tratamientos.

Por tanto, una cuestión principal que surge es saber si en las cadenas de las moléculas de GAG hay secuencias de sacáridos insertadas que coinciden con la conformación de la secuencia de aminoácidos primaria/3dimensional terciaria dentro la estructura polipeptídica de los factores de crecimiento controlando así su asociación, y por tanto la bioactividad, con una especificidad absoluta, o al menos relativa.

La proteína morfogenética ósea 2 (también denominada proteína morfogénica ósea 2, BMP2 o BMP-2) es un miembro de la superfamilia de FGF-fi fuertemente implicada en el desarrollo de hueso y cartílago. Es una proteína osteogénica, es decir, es un fuerte inductor de la diferenciación de osteoblastos (Marie et al. (22) "Ftegulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2, FGFFt-2 and BMP-2 signaling". Histol. Histopathol. 17 (3): 877-85). Se ha demostrado que el implante de esponjas de colágeno impregnadas con BMP-2 induce la formación de hueso nuevo (Geiger M, Li RH, Fñess W (noviembre de 23). Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2. Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (12): 1613-29.). La BMP2 humana recombinante está disponible para el uso ortopédico en Estados Unidos (por ejemplo, injerto óseo INFUSE®, Medtronic Inc, Estados Unidos).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una preparación de heparán sulfato, como se define en las reivindicaciones. Se ha descubierto que el HS/BMP2 potencia la generación, reparación y regeneración de tejido conectivo.

En un aspecto de la presente invención se proporciona heparán sulfato HS/BMP2. El HS/BMP2 puede proporcionarse en forma aislada o en forma sustancialmente purificada. La composición de la invención es al menos 97 % de heparán sulfato HS/BMP2 que puede unirse específicamente a la SEC ID N2: 1 o 6, o a la BMP2, en la que después de la digestión con heparín liasas (hepañnasa, heparitinasa I y II) hasta el final y posterior sometimiento de los fragmentos de disacáridos resultantes a HPLC de intercambio aniónico fuerte (SAX-HPLC), el heparán sulfato HS/BMP2 tiene una composición de disacáñdos que comprende:

UA-GlcN 8,2% (±3%);

UA-GIcNAc 17,5% (±3%);

UA-GlcN,6S 3,7 % (± 3 %);

UA,2S-GlcN 4,5 % (± 3 %);

UA-GIcNS 16,2 % (± 3 %);

UA,2S-GlcNS,6S ,5 % (± 3 %);

en la que la digestión se realiza disolviendo una muestra de HS/BMP2 (1 pg) en acetato sódico 1 mM/acetato cálcico ,2 M (pH 7,); digiriendo secuencialmente la muestra con heparinasa (1 mU/ml) a 37 2C durante 2 horas, seguido de heparitinasa I (1 mU/ml) a 37 2C durante 1 hora, seguido de heparitinasa II (1 mU/ml) a 37 2C durante 18 horas, seguido de una alícuota de cada dicha liasa a 37 2C durante 6 horas, en la que después de la digestión, las muestras se procesan en una columna de BioGel P-2 (1 x 12 cm) equilibrada con NH4HCO3 ,25 M, en la que el pico que comprende los disacáridos se liofiliza y después se disuelve en agua acidificada (pH 3,5 con HCI) y después se hace pasar sobre una columna ProPac PA-1 SAX-HPLC, en la que los disacáridos se eluyen con un gradiente lineal de NaCI de a 1, M (pH, 3,5) durante 6 minutos a un caudal de 1 ml/min.

En el presente documento se describen composiciones en las que el componente de heparán sulfato es al menos 8 % de HS/BMP2, más preferentemente es uno de al menos 85 %, 9 %, 95 %, 96 %, 98 %, 99 % o 1 %.

En realizaciones preferidas, el HS/BMP2 puede unirse a un péptido o polipéptido que tiene, o consta de, la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 1 o 6. En algunas realizaciones este péptido es la SEC ID N2: 1 o 6, en otras realizaciones es una proteína BMP2. En algunas realizaciones el HS/BMP2 se une a un péptido que tiene, o consta de, la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 1 o 6 con una Kd menor de 1 pM, más preferentemente menor de 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM.

En algunas realizaciones preferidas, el HS/BMP2 está N-sulfatado. Éste puede comprender la N-sulfatación de restos de /V-acetil-D-glucosamina (GIcNAc) en la cadena de oligosacáridos de heparán sulfato. Preferentemente al menos el 8 % de los restos de /V-acetil-D-glucosamina (GIcNAc) en el HS/BMP2 están N-sulfatados. En algunas realizaciones esto puede ser uno de al menos 85 %, 9 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 1 %.

En algunas realizaciones preferidas el HS/BMP2 está 6-O-sulfatado (O-sulfatación en el C6 de los restos de la N- sulfoglucosamina (GIcNS). Preferentemente, al menos el 8 % de los restos de A/-sulfoglucosamina (GIcNS) en el HS/BMP2 están 6-O-sulfatados. En algunas realizaciones, esto puede ser uno de al menos 85 %, 9 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 1 %.

El HS/BMP2 puede obtenerse, identificarse, aislarse o enriquecerse de acuerdo con la metodología de los inventores descrita en el presente documento, que puede comprender las siguientes etapas:

(i) proporcionar un soporte sólido que tenga moléculas polipeptídicas adheridas al soporte, en el que el polipéptido comprenda un dominio de unión a heparina que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N2: 1 6;

(¡i) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprenda glucosaminoglucanos de tal manera que puedan formarse complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(i¡¡) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados.

En la metodología de los inventores la mezcla puede comprender glucosaminoglucanos obtenidos de fuentes disponibles en el comercio. Una fuente adecuada es una fracción de heparán sulfato, por ejemplo, un heparán sulfato disponible en el comercio. Durante el aislamiento de heparina de mucosa intestinal de cerdo puede obtenerse una fracción adecuada de heparán sulfato (por ejemplo, de Celsus Laboratories Inc.- algunas veces denominado "HS Celsus"). Otras fuentes adecuadas de heparán sulfato incluyen heparán sulfato de cualquier mamífero (ser humano o no humano), particularmente... [Seguir leyendo]

1. Una composición de heparán sulfato aislada o purificada en la que el componente de heparán sulfato es al menos 97 % de heparán sulfato HS/BMP2 que puede unirse específicamente a la SEC ID N2: 1 o 6, o a la BMP2, en la que después de la digestión con heparín liasas (heparinasa, heparitinasa I y II) hasta el final y después de someter los fragmentos de disacárido resultantes a HPLC de intercambio aniónico fuerte (SAX-HPLC), el heparán sulfato HS/BMP2 tiene una composición de disacáridos que comprende:

UA-GlcN 8,2% (±3%);

UA-GIcNAc 17,5% (±3%);

UA-GlcN,6S 3,7 % (± 3 %);

UA,2S-GlcN 4,5 % (± 3 %);

UA-GIcNS 16,2 % (± 3 %);

UA,2S-GlcNS,6S ,5 % (± 3 %);

en la que la digestión se realiza disolviendo una muestra de HS/BMP2 (1 pg) en acetato sódico 1 mM / acetato cálcico ,2 M (pH 7,); digiriendo secuencialmente la muestra con heparinasa (1 mU/ml) a 37 2C durante 2 horas, seguido de heparitinasa I (1 mU/ml) a 37 2C durante 1 hora, seguido de heparitinasa II (1 mU/ml) a 37 2C durante 18 horas, seguido de una alícuota de cada dicha liasa a 37 2C durante 6 horas, en la que después de la digestión las muestras se procesan en una columna de BioGel P-2 (1 x 12 cm) equilibrada con NH4HCO3 ,25 M, en la que el pico que comprende los disacáridos se liofiliza y después se disuelve en el agua acidificada (pH 3,5 con HCI) y después se hace pasar sobre una columna ProPac PA-1 de SAX-HPLC, en la que los disacáridos se eluyen con un gradiente lineal de NaCI de a 1, M (pH, 3,5) durante 6 minutos a un caudal de 1 ml/min.

2. La composición de heparán sulfato aislada o purificada de la reivindicación 1, en la que el HS/BMP2 se une a la SEC ID N2: 1 con una Kd inferiora 1 pM.

3. La composición de heparán sulfato aislada o purificada de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el HS/BMP2 está A/-sulfatado y/o 6-O-sulfatado.

4. La composición de heparán sulfato aislada o purificada de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el heparán sulfato HS/BMP2 se obtiene por un método que comprende:

(i) proporcionar un soporte sólido que tenga las moléculas polipeptídicas adheridas al soporte, en el que el polipéptido comprenda un dominio de unión a heparina que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N2:

1 o 6;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una fracción de heparán sulfato obtenida durante el aislamiento de la heparina de la mucosa intestinal de cerdo de tal manera que los complejos de polipéptido - heparán sulfato puedan formarse;

(iii) separar los complejos de polipéptido-heparán sulfato del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-heparán sulfato;

(v) recoger el heparán sulfato disociado.

5. Una composición que comprende la composición de heparán sulfato aislada o purificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la proteína BMP2, células madre mesenquimales o BMP2 y células madre mesenquimales.

6. Un implante o prótesis biocompatible que comprende un biomaterial y una composición de heparán sulfato aislada o purificada en la que el componente de heparán sulfato es al menos 97 % de heparán sulfato HS/BMP2 que puede unirse específicamente a la SEC ID N2: 1 o 6, o a la BMP2, en la que después de la digestión con heparín liasas (heparinasa, heparitinasa I y II) hasta el final y después de someter los fragmentos de disacárido resultantes a HPLC de intercambio aniónico fuerte (SAX-HPLC), el heparán sulfato HS/BMP2 tiene una composición de disacáridos que comprende:

UA-GlcN 8,2% (±3%);

UA-GIcNAc 17,5 % (± 3 %);

UA-GlcN,6S 3,7 % (± 3 %);

UA,2S-GlcN 4,5 % (± 3 %);

UA-GIcNS 16,2 % (± 3 %);

UA,2S-GlcNS,6S ,5 % (± 3 %);

en la que la digestión se realiza disolviendo una muestra del HS/BMP2 (1 pg) en acetato sódico 1 mM/acetato cálcico ,2 M (pH 7,); digiriendo secuencialmente la muestra con heparinasa (1 mU/ml) a 37 2C durante 2 horas, seguido de heparitinasa I (1 mU/ml) a 37 2C durante 1 hora, seguido de heparitinasa II (1 mU/ml) a 37 2C durante 18 horas, seguido de una alícuota de cada dicha liasa a 37 2C durante 6 horas, en la que después de la digestión las

muestras se procesan en una columna de BioGel P-2 (1 x 12 cm) equilibrada con NH4HCO3 ,25 M, en la que el pico que comprende los disacáridos se liofiliza y después se disuelve en agua acidificada (pH 3,5 con HCI) y después se hace pasar sobre una columna ProPac PA-1 de SAX-HPLC, en la que los disacáridos se eluyen con un gradiente lineal de NaCI de a 1, M (pH, 3,5) durante 6 minutos a un caudal de 1 ml/min..

7. El implante o la prótesis de la reivindicación 6, en el que el implante o la prótesis se reviste o impregna con dicha composición, y de manera opcional se reviste o impregna adicionalmente con la proteína BMP2 y/o con células madre mesenquimales.

8. Un método para formar un implante o una prótesis biocompatible, comprendiendo el método la etapa de revestir o impregnar un biomaterial con una composición de heparán sulfato aislada o purificada, en la que el componente de heparán sulfato es al menos 97 % de heparán sulfato HS/BMP2 que puede unirse específicamente a la SEC ID N2: 1 o 6, o a la BMP2, en la que después de la digestión con las heparín liasas (heparinasa, heparitinasa I y II) hasta el final y después de someter los fragmentos de disacárido resultantes a HPLC de intercambio aniónico fuerte (SAX- HPLC), el heparán sulfato HS/BMP2 tiene una composición de disacáridos que comprende:

UA-GlcN 8,2% (±3%);

UA-GIcNAc 17,5% (±3%);

UA-GlcN,6S 3,7 % (± 3 %);

UA,2S-GlcN 4,5 % (± 3 %);

UA-GIcNS 16,2 % (± 3 %);

UA,2S-GlcNS,6S ,5 % (± 3 %);

comprendiendo el método opcionalmente además recubrir o impregnar el biomaterial con uno o ambos de proteína BMP2 y células madre mesenquimales, en el que la digestión se realiza disolviendo una muestra del HS/BMP2 (1 pg) en acetato sódico 1 mM/acetato cálcico ,2 M (pH 7,); digiriendo secuencialmente la muestra con heparinasa (1 mU/ml) a 37 2C durante 2 horas, seguido de heparitinasa I (1 mU/ml) a 37 2C durante 1 hora, seguido de: heparitinasa II (1 mU/ml) a 37 2C durante 18 horas, seguido de una alícuota de cada dicha liasa a 37 2C durante 6 horas, en el que después de la digestión las muestras se procesan en una columna de BioGel P-2 (1 x 12 cm) equilibrada con NH4HCO3 ,25 M, en el que el pico que comprende los disacáridos se liofiliza y después se disuelve en agua acidificada (pH 3,5 con HCI) y después se hace pasar sobre una columna ProPac PA-1 de SAX-HPLC, en la que los disacáridos se eluyen con un gradiente lineal de NaCI de a 1, M (pH, 3,5) durante 6 minutos a un caudal de 1 ml/min.

9. Medios de cultivo que comprenden una composición de heparán sulfato aislada o purificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

1. El uso de una composición de heparán sulfato aislada o purificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un cultivo celular in vitro, preferentemente para el cultivo de tejido conectivo in vitro.

11. Un método para cultivar tejido conectivo in vitro que comprende cultivar células madre mesenquimales en contacto con la composición de heparán sulfato aislada o purificada añadida de manera exógena de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Un método in vitro para promover la osteogénesis, comprendiendo el método administrar una composición de heparán sulfato aislada o purificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a células precursoras óseas o a células madre óseas, comprendiendo opcionalmente el método poner en contacto las células precursoras óseas o las células madre óseas con la proteína BMP2 simultáneamente con HS/BMP2.

13. El método de la reivindicación 12 en el que las células precursoras óseas o células madre óseas son células madre mesenquimales.