LA INVENCION SE REFIERE A LAS PROTEINAS Y GENES GNRH-R. LAS SECUENCIAS DE DNA PRESENTADAS PUEDEN TRATARSE MEDIANTE INGENIERIA GENETICA PARA FORMAR SISTEMAS DE EXPRESION DISEÑADOS PARA LA PRODUCCION DE GNRH-R Y/O LINEAS CELULARES QUE EXPRESEN EL GNRH-R Y PREFERIBLEMENTE RESPONDAN A LA TRANSDUCCION DE LA SEÑAL INDUCIDA POR GNRH.

DICHAS LINEAS CELULARES PUEDEN USARSE DE FORMA VENTAJOSA PARA TAMIZAR E IDENTIFICAR ANTAGONISTAS DEL GNRH. DE ACUERDO CON OTRO ASPECTO DE LA INVENCION, EL DNA GNRH, LAS SECUENCIAS DE OLIGONUCLEOTIDOS DE SENTIDO OPUESTO, LOS PRODUCTOS DE EXPRESION DE GNRH Y LOS ANTICUERPOS PARA TALES PRODUCTOS PUEDEN UTILIZARSE EN LA DIAGNOSIS Y EN LA TERAPIA DE LAS ENFERMEDADES REPRODUCTIVAS ASOCIADAS CON LA EXPRESION ANORMAL DEL GNRH-H; POR EJEMPLO LA SOBREEXPRESION, SUBEXPRESION O EXPRESION DE UN RECEPTOR MUTANTE DISFUNCIONAL. LOS ANIMALES TRANSGENICOS QUE CONTIENEN EL TRANSGEN GNRH-R PUEDEN UTILIZARSE COMO MODELOS ANIMALES PARA LA EVALUACION DE LOS ANALOGOS DEL GNRH "IN VIVO".

Clonación y expresión del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina.

1. Introducción

La presente invención se refiere a la clonación del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-R) y a células huésped modificadas por ingeniería genética que expresan el GnRH-R. Tales células diseñadas pueden usarse para evaluar y seleccionar fármacos y análogos de la GnRH implicados en la activación, regulación y desacoplamiento del \hbox{GnRH-R.}

2. Antecedentes de la invención

El GnRH-R es un mediador clave en la integración de los sistemas neurológico y endocrino. La reproducción normal depende de la liberación pulsátil de concentraciones fisiológicas de GnRH, que se une a receptores hipofisarios específicos de alta afinidad y desencadena la secreción de las gonadotropinas hormona luteinizante (LH) y hormona estimuladora del folículo (FSH). Mientras que concentraciones fisiológicas de GnRH orquestan la reproducción normal, niveles elevados de agonista conducen a una respuesta opuesta, la supresión de la secreción de gonadotropina. La capacidad de los análogos de la GnRH para activar e inhibir el eje hipotálamo-hipofisario-gonadal ha conducido a su utilidad clínica amplia en el tratamiento de una variedad de trastornos variables desde infertilidad a carcinoma prostático.

La respuesta y la capacidad del GnRH-R gonadótropo se ven influidas por los agonistas, la concentración y el patrón de exposición (Clayton, 1989, J Endocrinol. 120: 11-19). En estudios tanto in vivo como in vitro se ha demostrado que la concentración pulsátil baja de la GnRH es trófica para el receptor y que una concentración elevada de agonista induce la regulación por disminución y la desensibilización del receptor. La unión de la GnRH a su receptor estimula la fosfolipasa C y genera inositol-1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (Huckle y Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395). Estos segundos mensajeros, a su vez, liberan calcio desde los depósitos intracelulares y activan la proteína quinasa C. La regulación por aumento del receptor parece implicar a la proteína quinasa C y al calcio (Huckle y Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395; Huckle y col., 1988, Journal of Biological Chemistry 263: 3296-3302; Young y col., 1985, Journal of Endocrinology 107: 49-56). No está claro qué efectores subyacen a la regulación por disminución.

Sealfon S., C. y col., Molecular Endocrinology, vol. 4, nº 1, páginas 119-124, 1990, describen la caracterización de un receptor de la hormona liberadora de gonadotropina en ovocitos de Xenopus en los que se había inyectado ARN aislado de la hipófisis de rata y de una línea celular de gonadotropa: αT₃, un procedimiento para el fraccionamiento del ARN total de células αT₃ antes de la inyección en ovocitos de Xenopus, la fracción de ARN que, tras la inyección en ovocitos de Xenopus, genera la respuesta máxima a la GnRH en los ovocitos y el uso de la línea de células αT₃ como fuente adecuada para la clonación del ADNc del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina y el uso de la expresión en ovocitos de Xenopus como bioensayo.

Aunque se han hecho muchos progresos en la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación y desensibilización del GnRH-R a través de estudios de unión al receptor, la medición directa de la transcripción del gen del GnRH-R y su biosíntesis no ha sido posible. La clonación del ADNc del GnRH-R mejoraría la evaluación de la activación regulación y desacoplamiento del GnRH-R. La determinación de la secuencia primaria del receptor facilitaría el diseño dirigido de análogos mejorados. Sin embargo, a pesar del intenso interés, el gen del GnRH-R no se ha clonado ni expresado en ninguna especie.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a genes y proteínas del GnRH-R. La secuencias de ADN descritas en la presente memoria descriptiva pueden introducirse mediante ingeniería genética en sistemas de expresión diseñados para la producción del GnRH-R y/o líneas celulares que expresan el GnRH-R y preferentemente responden a la señal de transducción inducida por la GnRH. Tales líneas celulares pueden usarse de forma ventajosa para seleccionar e identificar agonistas y antagonistas de la GnRH. El ADN de la GnRH, las secuencias de oligonucleótidos antisentido, los productos de expresión de GnRH y los anticuerpos frente a tales productos pueden usarse en el diagnóstico y tratamiento de trastornos reproductivos asociados con la expresión anómala del GnRH-R; por ejemplo, la sobre expresión, la expresión disminuida o la expresión de un receptor mutante disfuncional. Los animales transgénicos que contienen el transgén GnRH-R pueden usarse como modelos animales para la evaluación de análogos de GnRH in vivo.

La aclaración de la secuencia del GnRH-R descrito en la presente memoria descriptiva refleja un avance de importancia en la endocrinología reproductiva y revela la naturaleza compleja de la transducción de señal y regulación del GnRH-R. Al contrario de la mayoría de señales hormonales, la GnRH se libera de un modo pulsátil, en la que la frecuencia y la amplitud de los pulsos transportan información crucial (Weiss y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 557-564; Hasenleder y col., 1991, Endocrinology 128: 509-517). La capacidad de unión al GnRH-r se regula por aumento o por disminución mediante agonistas en función de la duración de la exposición y la concentración (Loumaye y Catt., 1982, Science 215: 983-985). La utilidad clínica de los agonistas del GnRH, que ayuda a controlar diversas enfermedades humanas, incluidas hipertrofia prostática, cáncer de próstata, endometriosis y pubertad precoz, depende de esta inducción de desensibilización hipofisaria. La clonación del GnRH-R conducirá a una mayor comprensión de la interacción compleja de las hormonas hipotalámicas, hipofisarias y gonadales, que subyace a la farmacoterapia y la reproducción.

4. Descripción de las figuras

Figura 1. Interrupción por hibridación del receptor de serotonina (5HT) y expresión del GnRH-R por oligonucleótidos antisentido. Se introdujeron en el baño en las líneas horizontales 5HT 100 nM y GnRH 200 nM. A, respuesta a 5HT y GnRH en ovocitos en los que previamente se había inyectado una mezcla de ARN del cerebro de ratas (para la respuesta a 5HT), ARN de αT3 (para la respuesta a GnRH) y oligonucleótido antisentido del receptor 5HT_1C. Dieciocho células mostraron respuestas idénticas. B, respuesta a GnRH y 5HT en ovocitos en los que previamente se había inyectado una mezcla de ARN de cerebro de rata, ARN de αT3 y oligonucleótido antisentido WZ7. Veinticuatro células tuvieron respuestas idénticas.

Figura 2. Caracterización del clon WZ25 expresado en ovocitos. A, respuesta electrofisiológica a GnRH de ovocitos en los que se había inyectado el tránscrito WZ25 en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de antagonista de GnRH. Los tres trazados que se muestran proceden de células diferentes. Las líneas continuas y discontinuas indican la administración de GnRH y de antagonistas de GnRH, respectivamente. Los ovocitos que no habían recibido la inyección no mostraron respuesta a GnRH (n = 12). B, desplazamiento de ¹²⁵I-GnRH-A por GnRH-A y GnRH en membranas de ovocitos en los que se había inyectado el tránscrito de WZ25. También se muestra una curva comparativa del desplazamiento usando membranas de células αT3-1 combinadas con membranas de ovocitos en los que no se había inyectado nada (•). Las barras de error muestran el error típico de la media.

Figura 3. Secuencias de nucleótidos ( Nº1) y de aminoácidos deducidas (SEC ID Nº2) del clon WZ25. La numeración comienza con la primera metionina del marco de lectura abierto de 981 pares de bases. La secuencia de aminoácidos deducida se muestra debajo de la secuencia de nucleótidos. Las regiones transmembrana I-VII posibles están subrayadas. Los símbolos que aparecen debajo de las secuencias de aminoácidos indican los sitios potenciales de N-glucosilación (\blacktriangle) y los sitios de fosforilación para la proteínquinasa A (\blacklozenge), la caseínquinasa (•) y la proteínquinasa C (*)) (Hubbard e Ivatt, 1981, Ann Rev. Biochem. 50: 555-583; Kemp y Pearson, 1990, Trends Biochem, Sci. 15: 342-346; Pearson y Kemp, 1991, Meth. Enzymol. 200: 62-81; Kennelly y Krebs, 1991, J. Biol. Chem. 266: 15555-15558).

Figura... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:

2. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 y que codifica un receptor natural de GnRH, en la que las condiciones estrictas comprenden la hibridación en Pipes 2x, 50% de formamida, 0,5% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de arenque a 42ºC seguido por lavado con SSC 0,2x, 0,1% de SDS a 60ºC.

3. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

4. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:

5. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 y que codifica un receptor natural de GnRH, en la que las condiciones estrictas comprenden la hibridación en Pipes 2x, 50% de formamida, 0,5% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de arenque a 42ºC seguido por lavado con SSC 0,2x, 0,1% de SDS a 60ºC.

6. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3.

7. Un vector recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

8. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos reguladora que contiene información de regulación de la transcripción y de la traducción que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.

9. Un vector recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 y que codifica una proteína de fusión receptor de GnRH.

10. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 9 asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos reguladora que contiene información de regulación de la transcripción y de la traducción que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.

11. Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

12. Una célula sometida a ingeniería genética, que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8 ó 10.

13. Un receptor aislado de GnRH, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

14. Un receptor aislado natural de GnRH codificado por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con el ácido nucleico de la SEC ID Nº 1, en la que las condiciones estrictas comprenden la hibridación en Pipes 2x, 50% de formamida, 0,5% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de arenque a 42ºC seguido por lavado con SSC 0,2x, 0,1% de SDS a 60ºC.

15. Un receptor de GnRH aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4.

16. Un receptor aislado natural de GnRH codificado por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con el ácido nucleico de la SEC ID Nº 3, en la que las condiciones estrictas comprenden la hibridación en Pipes 2x, 50% de formamida, 0,5% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de arenque a 42ºC seguido por lavado con SSC 0,2x, 0,1% de SDS a 60ºC.

17. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular, transmembrana o citoplásmico del receptor de GnRH de la reivindicación 13, 14, 15 ó 16.

18. Una proteína de fusión que comprende la proteína receptor de GnRH, o un polipéptido o péptido de la reivindicación 13 ó 15 unido a una proteína o péptido heterólogo.

19. Una composición para la anticoncepción en un mamífero, quecomprende un receptor de GnRH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

20. Una composición para la anticoncepción en un mamífero, que comprende un receptor de GnRH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4.

21. Una composición para la anticoncepción en un mamífero, que comprende una proteína de fusión receptor de GnRH que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2.

22. Una composición para la anticoncepción en un mamífero, quecomprende una proteína de fusión receptor de GnRH que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 4.

23. Uso de un receptor de GnRH que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la fabricación de una composición para la anticoncepción en un mamífero.

24. Uso de un receptor de GnRH que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4 en la fabricación de una composición para la anticoncepción en un mamífero.

25. Uso de una proteína de fusión receptor de GnRH que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 ó 4 en la fabricación de una composición para la anticoncepción en un mamífero.

26. Un procedimiento para producir receptor recombinante de GnRH, que comprende:

27. Un procedimiento para producir proteína de fusión receptor recombinante de GnRH, que comprende:

28. Un oligonucleótido antisentido complementario a un gen que codifica el receptor de GnRH de las reivindicaciones 13, 14, 15 ó 16, que inhibe la transcripción del gen en una célula.

29. El oligonucleótido de la reivindicación 28, que es complementario a una secuencia de nucleótidos que codifica la región transmembrana del receptor de GnRH de las reivindicaciones 13, 14, 15 ó 16.

30. Un anticuerpo monoclonal que se une de forma inmunoespecífica a un epítopo del receptor de GnRH de las reivindicaciones 13, 14, 15 ó 16.

31. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 30, que inhibe de forma competitiva la unión de GnRH al receptor de GnRH de las reivindicaciones 13, 14, 15 ó 16.

32. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 30 ó 31, que se une al receptor de GnRH de las reivindicaciones 13, 14, 15 ó 16, en el que el receptor de GnRH es humano.

33. Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la transducción de señal del receptor de GnRH, que comprende:

34. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la actividad de la señal del receptor de GnRH se mide mediante el análisis para determinar la estimulación o la inhibición de la actividad de la fosfolipasa C.

35. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la actividad de transducción de señal del receptor de GnRH se mide mediante el análisis para determinar la estimulación o la inhibición de la actividad del fosfato de inositol (IP).

36. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la actividad de transducción de señal del receptor de GnRH se mide mediante el análisis paradeterminar la liberación de iones de calcio desde fuentes intracelulares.