Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos.

Uso de un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para la fabricación de un medicamentopara uso en prevenir o tratar una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto,

en donde el genomadel virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de unacepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidosde la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepadel virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácidoN terminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidaddeteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular, y en donde el virus de la gripe atenuado modificadopor ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 dela cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.

Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos.

1. Introducción La presente invención se refiere, en general, al uso de virus de la gripe atenuados que tienen un capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón (IFN) celular.

La invención se refiere al uso de virus de la gripe atenuados que tienen modificaciones en el gen NS1 que disminuyen o eliminan la capacidad del producto del gen NS1 de antagonizar la respuesta al IFN celular. Los virus mutantes se replican in vivo, pero demuestran una patogenicidad reducida y, por tanto, son muy adecuados para uso en vacunas de virus vivos y formulaciones farmacéuticas.

2. Fundamento de la invención

2.1 El virus de la gripe Las familias de virus que contienen RNA monocatenario con envolvente del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae y virus de la enfermedad de Borna) o los que tienen genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae) . La familia Orthomyxoviridae, descrita con detalle más adelante, y empleada en los ejemplos de la presente memoria, incluye los virus de la gripe, tipos A, B y C, así como los virus de Thogoto y de Dhori y el virus de la anemia infecciosa de los salmones.

Los viriones de la gripe consisten en un núcleo de ribonucleoproteína interno (una nucleocápsida helicoidal) que contiene el genoma de RNA monocatenario, y una envolvente de lipoproteína externa revestida en el interior por una proteína de la matriz (M1) . El genoma segmentado del virus de la gripe A consiste en ocho moléculas (siete para el virus de la gripe C) de RNA monocatenarios de polaridad negativa, lineales que codifican diez polipéptidos, que incluyen: las proteínas RNA-polimerasas dependientes de RNA (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteína (NP) que forman la nucleocápsida; las proteínas membranales de la matriz (M1, M2) ; dos glicoproteínas de superficie que sobresalen de la envolvente que contiene lípidos: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) ; la proteína no estructural (NS1) y la proteína de exportación nuclear (NEP) . La transcripción y replicación del genoma tiene lugar en el núcleo y el ensamblaje ocurre por medio gemación en la membrana plasmática. Los virus pueden intercambiar genes durante las infecciones mixtas.

El virus de la gripe adsorbe por medio de la HA los sialiloligosacáridos de las glicoproteínas y los glicolípidos de la membrana celular. Después de la endocitosis del virión, ocurre un cambio conformacional en la molécula de HA dentro del endosoma celular lo que facilita la fusión de las membranas, desencadenando así el des-revestimiento. La nucleocápsida migra al núcleo en donde se transcribe el mRNA viral. El mRNA viral se transcribe por un mecanismo único en el cual la endonucleasa viral escinde el extremo 5' protegido de los mRNA heterólogos celulares que luego sirven como cebadores para la transcripción de los moldes de los RNA virales por la transcriptasa viral. Los transcritos terminan en sitios situados en 15 a 22 bases desde de los extremos de sus moldes, en donde las secuencias de oligo (U) actúan como señales para la adición de tramos de poli (A) . De las ocho moléculas de RNA virales, así producidas, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos directamente a las proteínas que representan HA, NA, NP y las proteínas polimerasas virales, PB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos experimentan empalme, proporcionando cada uno dos mRNA que se traducen en diferentes marcos de lectura para producir M1, M2, NS1 y NEP. En otras palabras, los ocho segmentos de RNA virales codifican diez proteínas: nueve estructurales y una no estructural. Un resumen de los genes del virus de la gripe y sus productos proteínicos se muestra en la Tabla I siguiente.

TABLA 1 SEGMENTOS DE RNA DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA GRIPE Y ASIGNACIONES DE CODIFICACIÓNa

Segmento Longitudb (nucleótidos) Polipéptido codificadoc Longitudd (aminoácidos) Moléculas por virión Comentarios

1 2341 PB2 759 30-60 Componente de RNA transcriptasa; unión de la protección del RNA celular del hospedante.

2 2341 PB1 757 30-60 Componente de RNA transcriptasa; Iniciación de la transcripción.

3 2233 PA 716 30-60 Componente de RNA transcriptasa.

4 1778 HA 566 500 Hemaglutinina; trímero; glicoproteína de la envolvente; media la unión a las células.

5 1565 NP 498 1000 Nucleoproteína; asociada con RNA; componente estructural de RNA transcriptasa.

6 1413 NA 454 100 Neuraminidasa; tetrámero; glicoproteína de la envolvente.

7 1027 M1 252 3000 Proteína de la matriz; reviste el interior de la envolvente.

M2 96 ? Proteína estructural de la membrana plasmática; mRNA empalmado.

8 890 NS1 230 - Proteína no estructural; función desconocida

NEP 121 ? Proteína de exportación nuclear; mRNA empalmado

a Adaptado de R. A. Lamb and P. W. Choppin (1983) , Annual Review of Biochemistr y , Volume 52, 467-506. b Para la cepa A/PR/8/34. c Determinado por métodos bioquímicos y genéticos d Determinada por análisis de secuencias de nucleótidos y secuenciación de proteínas

El genoma del virus de la gripe A contiene ocho segmentos de RNA monocatenario de polaridad negativa, que codifican una proteína no estructural y nueve proteínas estructurales. La proteína no estructural NS1 es abundante en 5 células infectadas con el virus de la gripe, pero no ha sido detectada en viriones. NS1 es una fosfoproteína encontrada en el núcleo tempranamente durante la infección y también en el citoplasma en tiempos más tardíos del ciclo viral (King et al., 1975, Virology 64:378) . Estudios con virus mutantes de la gripe sensibles a la temperatura (ts) que llevan lesiones en el gen NS sugirieron que la proteína NS1 es un regulador transcripcional y post-transcripcional de los mecanismos por los cuales el virus es capaz de inhibir la expresión de genes de la célula hospedante y estimular 10 la síntesis de proteínas virales. Igual que otras muchas proteínas que regulan los procesos post-transcripcionales, la proteína NS1 interactúa con secuencias y estructuras de RNA específicas. Se ha descrito que la proteína NS1 se une a diferentes especies de RNA que incluyen: vRNA, poli-A, U6 snRNA, región no traducida en 5' de de los mRNA virales y dsRNA (Qiu et al., 1995, RNA 1:304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68:2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73:3325-9. La expresión de la proteína NS1 a partir de cDNA en células transfectadas ha sido asociada con diversos efectos: inhibición del transporte nucleo-citoplásmico de mRNA, inhibición del empalme de pre-mRNA, inhibición de la poliadenilación del mRNA del hospedante y estimulación de la traducción del mRNA viral (Fortes, et al., 1994, EMBO J. 13:704; Enami, et al., 1994, J. Virol. 68:1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8:1817; Park, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen, et al., 1994, EMBO J. 18:2273-83) .

2.2 Virus atenuados Las vacunas de virus inactivados se preparan "matando" el patógeno viral, por ejemplo, por calor o tratamiento con formalina, de modo que no sea capaz de replicación. Las vacunas inactivadas tienen una utilidad limitada porque no proporcionan inmunidad de larga duración y, por tanto, confieren una protección limitada. Una propuesta alternativa para producir vacunas de virus implica el uso vacunas de virus vivos atenuados. Los virus atenuados son capaces de replicación pero no son patógenos y, por tanto, proporcionan una inmunidad de mayor duración y confieren mayor protección. Sin embargo, los métodos convencionales para producir virus atenuados implican el aislamiento al azar de mutantes de la gama del hospedante, muchos de los cuales son sensibles a la temperatura; por ejemplo, el virus se somete a pases a través de hospedantes no naturales, y se seleccionan los virus de la progenie que son inmunógenos, pero no patógenos.

Un sustrato convencional para aislar y hacer crecer virus de la gripe para fines vacunales son los huevos de pollo embrionados. Los virus de la gripe se hacen crecer típicamente durante 2-4 días a 37ºC en huevos de 10-11 días. Aunque la mayoría de los aislados primarios humanos de los virus de la gripe A y B crecen mejor en el saco amniótico de los embriones, después de 2 a 3 pases los virus llegan a adaptarse a crecer en las células de la cavidad alantoidea, que es accesible desde el exterior del huevo (Murphy, B. R., and R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses pp. 1397-1445. En Fields Virology. Lippincott-Raven P. A.) .

La tecnología del DNA recombinante... [Seguir leyendo]

1. Uso de un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para la fabricación de un medicamento para uso en prevenir o tratar una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, en donde el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido N terminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular, y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe B.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.

6. El uso de la reivindicación 1 o 3, en donde el virus de la gripe atenuado es NS1/99.

7. El uso de la reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, en donde el virus de la gripe atenuado, cuyo genoma codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos, 1-120 aminoácidos, 1-110 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-99 aminoácidos, 1- 90 aminoácidos, 1-70 aminoácidos o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, es un virus de la gripe A.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el virus de la gripe atenuado es un virus de la gripe B.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad infecciosa es una infección viral.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde la infección viral es una infección por virus de la gripe.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración del virus de la gripe atenuado es aproximadamente 104 a aproximadamente 5x106 UFP.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se formula para administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural u oral.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el medicamento se formula para administración pulmonar.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto es un ser humano.

15. Un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética, en donde el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido N terminal es el

número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular para uso en tratar o prevenir una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.

16. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.

17. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe B.

18. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.

19. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con las reivindicaciones 15, 16 o 18, en donde el virus de la gripe atenuado, cuyo genoma codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos, 1-120 aminoácidos, 1-110 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-99 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-70 aminoácidos o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, es un virus de la gripe A.

20. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde el virus de la gripe atenuado es un virus de la gripe B.

21. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el virus se formula para administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural u oral.

22. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el virus se formula para administración pulmonar.

23. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en donde la enfermedad infecciosa es una infección viral.

24. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la infección viral es una infección por virus de la gripe.

25. El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en donde el sujeto es un ser humano.