Anticuerpos glucosilados.

Un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1 o IgG3 humano que está glucosilado con una cadena de azúcares en laAsn297,

y dicho anticuerpo se caracteriza porque

a) la cantidad de fucosa en dicha cadena de azúcares, en relación con la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 nimanosa 5, del 100%, y analizado mediante un análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometríade masas (LCMS) es de al menos del 99%,

b) y además la cantidad de NGNA en dicha cadena de azúcares, en relación a la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4ni manosa 5, del 100%, y analizado mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometríade masas (LCMS), es del 1% o inferior, y/ o la cantidad de alfa 1,3-galactosa N-terminal en dicha cadena deazúcares está relacionada con la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizada medianteanálisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) es del 1% o inferior.

Anticuerpos glucosilados La presente invención está relacionada con un anticuerpo recombinante con una región Fc expresada y glucosilada, en la que la estructura carbohidrato nuclear principal unida a la región Fc del anticuerpo está completamente fucosilada. La presente invención está relacionada también con las células huésped CHO (de ovario de hámster chino) , los métodos para seleccionar tales células huésped CHO y la utilización de tal anticuerpo recombinante.

Antecedentes de la invención Las inmunoglobulinas o anticuerpos en su forma nativa normalmente son glucoproteínas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Los anticuerpos contienen dominios constantes que sirven para asignar a los anticuerpos en las diferentes clases, como IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, y varias subclases, como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos de humanos de las clases IgG1 e IgG3 a menudo intervienen en la CCDA (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) .

También se conocen otras moléculas que son similares a los anticuerpos y contienen, por ejemplo, un dominio de unión de una proteína heteróloga como un receptor, ligando o enzima, y la región Fc de un anticuerpo. Tales proteínas de fusión Fc se describen, por ejemplo, en Stabila, P., et al., Nature Biotech 16 (1998) 1357-1360 y la US

5.610.297.

Los anticuerpos monoclonales son responsables de cuatro funciones efectoras: CCDA, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la tasa de vida media/ eliminación. La CCDA y la fagocitosis están mediadas a través de la interacción de los anticuerpos unidos a la célula con los FcyR (receptores Fc gamma) ; la CDC a través de la interacción de los anticuerpos unidos a la célula con una serie de proteínas que constituyen el sistema del complemento. La CDC está relacionada con la activación de C3 unido a Clq y/o a la unión con el receptor Fc de la parte Fc. Si debe reducirse la activación de C3 unido a Clq y/o la union al receptor Fc de la parte constante un anticuerpo, a menudo se utilizan anticuerpos IgG4, que no activan el sistema del complemento, no se unen a Clq y no activan el C3. Alternativamente, se utilizan regiones Fc que comprenden una región constante de la cadena pesada gamma-1 con ciertas mutaciones, como L234A y L235A o D265A y N297A (WO 99/51642) .

Es bien conocida en la material la modificación de los dominios constantes de los anticuerpos para mejorar sus funciones efectoras. Tales métodos se describen, por ejemplo, en la WO 99/54342.

Routier, F.H. et al., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 describen el patrón de glucosilación de un anticuerpo IgG1 humanizado expresado en células CHO-DUKX. Este anticuerpo muestra una proporción molar de Fuc: Man de 0, 8 : 3, 0, lo que indica una proporción de fucosilación del 80%. Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 describen anticuerpos IgG1 e IgG3 anti-CD20 producidos a través de la recombinación en CHO DG44 con una fucosilación de alrededor del 90%. Mimura, Y et al., J. Immunol. Methods 247 (2001) 205-216 describen que el butirato aumenta la producción de IgG quiméricos humanos en las células CHO-K1 manteniendo su funcionalidad y perfil de glucoformas. Los perfiles de oligosacáridos muestran un contenido considerable de estructuras glucano afucosiladas. Raju, T.S., BioProcess International 1 (2003) 44-53 describen el impacto de la variación de la glucosilación por los sistemas de expresión en la actividad biológica de las inmunoglobulinas terapéuticas y su nomenclatura. Ma, S., Anal. Chem. 71 (1999) 5185-5192 describen el análisis de los carbohidratos del rituximab. El rituximab muestra una fucosilación del 9-10% (Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160) . Fujii, S., J. Biol. Chem. 265 (1990) 6009-6018 describen que la IgG bovina incluye alrededor del 11% de IgG afucosilada. Mizouchi, T., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020 describen que la IgG humana está afucosilada en alrededor del 14%. Bergwerff, A.A., Glycoconjugate J. 12 (1995) 318-330 describen que los anticuerpos producidos en los ratones SP2/0 contienen oligosacáridos de ácido N-glucolilneuramínico (NGNA) en grandes cantidades. Nahrgang, S. et al., en Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. et al. (Ed.) , Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999, págs. 259-261, describen que para la expresión en CHO de IgG1 tras la transfección transitoria se encontró una glucosilación total baja. Lund, J. et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748 describen que producción recombinante de un anticuerpo quimérico de ratón-humano en células de transfectoma de ratón. El anticuerpo IgG1 está afucosilado en una cantidad del 13%. Patel, T.P. et al., Biochem. J. 285 (1992) 839845 describen la glucosilación de anticuerpos a partir de células de hibridoma y ascites de ratón. Niwa, R et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160, describen para el anticuerpo IgG1 CD20 una fucosilación del 91% tras una producción recombinante en CHO DG44 y Mori, K. et al., Biotech. Bioeng. 88 (2004) 901-908, una fucosilación del 94%. Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 describen que la expresión de anticuerpos con glucoformas alteradas conduce a un aumento de la CCDA. Por lo tanto, el anticuerpo de Davies no está fucosilado en una cantidad considerable. Sheeley, D.M., et al., Anal. Biochem. 247 (1997) 102-110 comparan la glucosilación de los anticuerpos en diferentes sistemas de expresión. Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 describen que la ausencia de fucosa en el Fc de la IgG1 humana mejora la unión a FcyR111 y la CCDA. Un anticuerpo anti-Her2 que está fucosilado en alrededor del 90% también muestra CCDA en una cantidad considerable. Zhu, L., et al., Nature Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169 describen la producción de anticuerpos humanos en huevos de gallina. Las patentes WO 2004/087756 y WO 2005/005635 describen anticuerpos mejorados frente a IGF-1R.

Resumen de la invención Un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1 o IgG3 humano que está glucosilado con una cadena de azúcares en la Asn297, y dicho anticuerpo se caracteriza porque a) la cantidad de fucosa en dicha cadena de azúcares, en relación con la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizado mediante un análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) es de al menos del 99%,

b) y además la cantidad de NGNA en dicha cadena de azúcares, en relación a la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizado mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) , es del 1% o inferior, y/ o la cantidad de alfa 1, 3-galactosa N-terminal en dicha cadena de azúcares en relación a la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizada mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) es del 1% o inferior. ´

De acuerdo con la invención "cantidad" significa la cantidad de dicho azúcar en la cadena de azúcares en la Asn297, en relación con la suma de G0, G1, G2 (sin manosa (4 y 5) ) , del 100% y como se calcula en el ejemplo 3.

De acuerdo con la invención es posible proporcionar anticuerpos y/o células CHO huésped con una fucosilación de incluso el 99, 4% o superior, 99, 5% o superior, o 99, 9% o superior.

Preferiblemente la cantidad de NGNA es del 0, 5% o inferior, más preferiblemente del 0, 1% o inferior, e incluso no detectable mediante LCMS (cromatografía líquida / espectrometría de masas) .

Preferiblemente la cantidad de alfa 1, 3-galactosa N-terminal es del 0, 5% o inferior, más preferiblemente del 0, 1% o inferior e incluso no detectable mediante LCMS.

La cadena de azúcares preferiblemente poseen las características de los glucanos N-ligados, y está unida a la Asn297 de un anticuerpo expresado de forma recombinante en una célula CHO.

Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano, quimérico.

La invención también comprende la línea celular CHO hu MAb<IGF-1R>B1-4E10_9-16) depositada bajo el tratado de Budapest de reconocimiento internacional del depósito de microrganismos con el propósito de iniciar un proceso de patente, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Alemania, el 21 de junio de 2006, con el nº de registro DSM ACC 2795. Esta línea celular es capaz de producir un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Las cantidades de azúcar preferibles se mencionan anteriormente.

Preferiblemente, la célula CHO es una célula CHO que comprende la deleción (por ejemplo DG44) o la inactivación... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1 o IgG3 humano que está glucosilado con una cadena de azúcares en la Asn297, y dicho anticuerpo se caracteriza porque a) la cantidad de fucosa en dicha cadena de azúcares, en relación con la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizado mediante un análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) es de al menos del 99%,

b) y además la cantidad de NGNA en dicha cadena de azúcares, en relación a la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizado mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) , es del 1% o inferior, y/ o la cantidad de alfa 1, 3-galactosa N-terminal en dicha cadena de azúcares está relacionada con la suma de G0, G1, G2 sin manosa 4 ni manosa 5, del 100%, y analizada mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LCMS) es del 1% o inferior.

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque la cantidad de NGNA es del 0, 5% o inferior.

3. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza porque la cantidad de alfa 1, 3galactosa N-terminal es del 0, 5% o inferior.

4. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3, que se caracteriza porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano, quimérico.

5. La línea celular CHO es la DSM ACC 2795.

6. La utilización de un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 4 para la fabricación de un medicamento.

7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 4.

8. La utilización de una célula CHO de acuerdo con la reivindicación 5 para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 4.

9. Un método para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con las reivindicaciones de 1a4enuna célula CHO de acuerdo con la reivindicación 5.