Anticuerpos anti il-6, composiciones, métodos y usos.

Anticuerpo o fragmento de anticuerpo híbrido capaz de inhibir la IL-6 humana,

que comprende una región variable de la cadena pesada de la SEC ID Nº 7 y una región variable de la cadena ligera de la SEC ID Nº 8.

Anticuerpos anti il-6, composiciones, métodos y usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos, incluidas variantes o porciones especificadas, específicas para al menos una proteína interleucina-6 (IL-6 también conocida como interferón β2) o fragmento de la misma, así como los ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-IL-6, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospedadoras y métodos para crear y utilizar los mismos, incluidos dispositivos, administración y formulaciones terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La interleucina-6 (IL-6) es una citocina pro-inflamatoria que es producida por muchos tipos diferentes de células. In vivo, las células endoteliales, los fibroblastos y los monocitos estimulados representan las principales fuentes de IL-6. Otras células tales como macrófagos, linfocitos T y B, granulocitos, queratinocitos, mastocitos, osteoblastos, condrocitos, células gliales y células del músculo liso también producen IL-6 tras ser estimulados (Kishimoto, T., Blood 74:1-10 (1989) y Kurihara, N. et al., J. Immunology 144:4226-4230 (1990) ) . Varias células tumorales también producen IL-6 (Smith, P.C. et al. Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001) ) y, recientemente, se ha indicado que IL-6 es un factor pronóstico de la evolución del cáncer de próstata (Nakashima, J. et al. Clinical Cancer Research 6:2702-2706 (2000) ) . La producción de IL-6 puede ser regulada por la propia IL-6 y dependiendo del tipo de célula, la IL-6 puede estimular o inhibir su propia síntesis.

La IL-6 puede unirse al receptor de IL-6 expresado en monocitos periféricos, linfocitos T y linfocitos B activados por mitógenos, y determinados tumores (Ishimi, Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990) ) . El receptor de IL-6 tiene al menos dos componentes diferentes y está compuesto por una cadena alfa denominada gp80 que es responsable de la unión de IL-6 y una cadena beta denominada gp130 que es necesaria para la transducción de señales (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998) y Poli, V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994) ) . La familia de citocinas que incluye IL-6, LIF, oncostatina M, IL-11, CNTF y CT-1, todas señalizan a través de gp130 después de la unión a sus receptores afines. Además, todos los miembros de la familia de citocinas IL-6 pueden inducir la expresión hepática de proteínas de fase aguda (Bellido, T. et al., J. Clin. Investigation 97:431-437 (1996) ) . 87908790.

Existen al menos dos funciones biológicas principales de la IL-6: la mediación de las proteínas de fase aguda y actuar como factor de diferenciación y activación (Avvisti, G. et al., Baillieres Clinical Hematology 8:815-829 (1995) y Poli, V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994) ) . Las proteínas de fase aguda son conocidas por regular las respuestas inmunitarias, intervenir en la inflamación y desempeñar un papel en la remodelación tisular. Como factor de diferenciación y activación, IL-6 induce la diferenciación y secreción de anticuerpos de los linfocitos B, induce la diferenciación de linfocitos T a linfocitos T citotóxicos, activa los factores de señalización celular y promueve la hematopoyesis (Ishimi, Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990) ) . IL-6 está implicada de manera destacada en muchos procesos y funciones corporales críticas. Como resultado, pueden potenciarse, suprimirse o impedirse los procesos fisiológicos, incluidos el metabolismo óseo, la transformación neoplásica y las respuestas inflamatoria e inmunitaria, manipulando la actividad biológica de la IL-6 in vivo por medio de un anticuerpo (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998) ) .

Aunque la IL-6 está implicada en muchas vías, los ratones knockout para IL-6 tienen un fenotipo normal, son viables y fértiles, y estos animales presentan una ligera disminución del número de linfocitos T y una disminución de la respuesta de proteínas de fase aguda a la lesión tisular (Kopf M et al., Impaired immune and acute-phase responses in interleukin-6-deficient mice, Nature; 368 (6469) :339-42, 1994) . Por el contrario, los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-6 desarrollan una enfermedad neurológica tal como neurodegeneración, astrocitosis, vasculogénesis cerebral, y estos ratones no desarrollan una barrera hematoencefálica (Campbell et al., Neurologic Disease Induced in Transgenic Mice by Cerebral Overexpression of Interleukin 6 PNAS 90: 10061-10065, 1993) .

Estudios recientes han indicado que un Mab contra la IL-6 puede inhibir el crecimiento in vivo de tumores de próstata (Smith, P.C. y Keller, E.T., The Prostate en prensa y Okamoto, M. et al., Cancer Research 57:141-146 (1997) y el carcinoma renal (Weissglas, M. et al., The Journal of Urology 153:554-557 (1995) ) . Además de un efecto directo sobre el crecimiento tumoral, el bloqueo de la producción de IL-6 puede también quimio-sensibilizar y potenciar la eficacia citotóxica (Smith, P.C. et al. Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001) ) . Colectivamente, la literatura nos enseña que el bloqueo de la actividad de IL-6 puede inhibir la degradación ósea, el crecimiento tumoral y la caquexia por cáncer.

La inmunoterapia pasiva que emplea anticuerpos policlonales no humanos (por ejemplo, antisueros) o anticuerpos monoclonales (Mab) y fragmentos de los mismos (por ejemplo, productos de digestión proteolítica de los mismos) son posibles agentes terapéuticos que están siendo desarrollados como tratamientos para diversas enfermedades. Sin embargo, se sabe que los anticuerpos compuestos por porciones no humanas provocan una respuesta inmunitaria cuando se administran a los seres humanos. Esta respuesta inmunitaria hace que la administración repetida de anticuerpos resulte a menudo inadecuada para el tratamiento y puede dar lugar a la eliminación mediada por inmunocomplejos de los anticuerpos de la circulación, reduciendo así el beneficio terapéutico para los pacientes. Los ejemplos de afecciones que pueden atribuirse a la administración repetida de anticuerpos compuestos por porciones no humanas son la enfermedad del suero y la anafilaxia.

En un intento de evitar estos y otros problemas, se han aplicado varios enfoques, incluidos la quimerización y la "humanización" para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos/fragmentos de los mismos. Estos enfoques han producido anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Estos anticuerpos son sustancialmente de origen humano, no siendo de origen humano sólo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y determinados restos de la región estructural que influyen en la conformación de las CDR. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales humanizados o humanos novedosos son especialmente útiles en solitario o en combinación con moléculas existentes para usos inmunoterapéuticos.

Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos humanos o híbridos neutralizantes de alta afinidad contra la IL-6, o fragmentos de los mismos, que superen uno más de estos problemas, así como mejoras sobre los anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos para su uso en la prevención, el tratamiento, la mejora o el diagnóstico de las afecciones relacionadas con la IL-6.

Los anticuerpos murinos monocolonales contra la IL-6 producidos a partir de una línea celular de hibridoma se conocen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.618.700 y en la patente de EE.UU. 6.086.874. La patente de EE.UU. 5.856.135 describe anticuerpos humanos reformados contra la IL-6 humana derivados de un anticuerpo monoclonal de ratón SK2 en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable del anticuerpo de ratón SK2 se trasplantan a la región variable de un anticuerpo humano y se unen a la región constante de un anticuerpo humano.

Se han descrito y categorizado otros anticuerpos monoclonales murinos como neutralizantes, es decir, que evitan la unión al receptor, o no neutralizantes (Brakenhoff et al., J. Immunol. (1990) (145:561) . Entre este conjunto de anticuerpos, los anticuerpos monoclonales neutralizantes contra IL-6 pueden dividirse en dos grupos; y los supuestos epítopos en la molécula de IL-6 pueden denominarse Sitio I y Sitio II. El Sitio I evita la unión a la gp80 (IL6R) y por lo tanto evita la activación de gp130. El epítopo Sitio I se caracterizó adicionalmente por comprender regiones de las porciones amino terminal y carboxilo terminal de la molécula de IL-6. Los ligantes del Sitio II evitan la activación de gp130 y por lo tanto pueden reconocer un epítopo conformacional implicado en la señalización.

En van Zaanen et al., British Journal of Haematology (1998) (783-790) se analiza un anticuerpo híbrido... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo híbrido capaz de inhibir la IL-6 humana, que comprende una región variable de la cadena pesada de la SEC ID Nº 7 y una región variable de la cadena ligera de la SEC ID Nº 8.

2. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento neutraliza al menos una actividad de la IL-6 humana, tal como la inhibición de la secreción de IgM mu de las células SKW6.4, la inhibición de la producción de MCP-1 mediada por IL-6, la inhibición de la señalización de IL-6 en células THP-1 de leucemia monocítica humana, la inhibición de la producción de amiloide A sérico inducida por IL-6 de las células HepG2 y la inhibición de la proliferación celular inducida por rhIL-6.

3. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Composición de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6, que comprende un ácido nucleico aislado según la reivindicación 3 y un vehículo o diluyente.

5. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3.

6. Vector según la reivindicación 5, en el que dicho vector comprende al menos uno de entre un promotor temprano

o tardío de SV490, un promotor de CMV, un promotor tk de HSV, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa) , un promotor de inmunoglobulina humana o un promotor EF-1 alfa.

7. Vector según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicho vector comprende al menos una porción de al menos uno de entre un gen de selección de glutamina sintetasa (GS) , neomicina (G418) , dihidrofolato reductasa (DHFR) , proteína verde fluorescente (GFP) o metotrexato (MTX) .

8. Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado según la reivindicación 3.

9. Célula hospedadora según la reivindicación 8, en la que dicha célula hospedadora es una célula COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma o de linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

10. Método para producir al menos un fragmento o anticuerpo anti-IL-6, que comprende traducir un ácido nucleico según la reivindicación 3, en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de manera que el fragmento o anticuerpo anti-IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables.

11. Composición que comprende un fragmento o anticuerpo anti-IL-6 aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y un vehículo o diluyente.

12. Composición según la reivindicación 11, que comprende al menos uno de entre agua estéril, agua tamponada estéril o al menos uno de los siguientes conservantes: fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio, timerosal y mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso.

13. Composición según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que la concentración de fragmento o anticuerpo anti-IL-6 es de 0, 1 mg/ml a 100 mg/ml.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende adicionalmente al menos uno de entre un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) , un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un mineral, una sustancia nutricional, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una epoetina, un filgrastim, un sargramostim, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un modulador del receptor de estrógenos, un midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitótico, un radiofármaco, un antidepresivo, un antimaníaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina, dornasa alfa y una citocina.

15. Dispositivo médico que comprende al menos un fragmento o anticuerpo anti-IL-6 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar dicho al menos un fragmento o anticuerpo anti-IL-6 por vía intravenosa, intraocular, subcutánea, respiratoria, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, transdérmica, por bolo o por inhalación.

16. Artículo de fabricación para su uso farmacéutico humano, que comprende material de envasado y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de al menos un fragmento o anticuerpo anti-IL-6 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

17. Anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, dispositivo médico según la reivindicación 15 o artículo de fabricación según la reivindicación 16 para su uso en un tratamiento.

18. Anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, dispositivo médico según la reivindicación 15 o artículo de fabricación según la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunitario en un ser humano o en un animal.

19. Método para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende transfectar una célula hospedadora o animal transgénico no humano o planta transgénica o célula vegetal capaz de expresar en cantidades recuperables dicho anticuerpo con una molécula de ácido nucleico que codifica tal anticuerpo y recuperar el anticuerpo de la célula, animal o vegetal.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero no humano, una célula vegetal o una célula de levadura.

21. Método según la reivindicación 20, en el que dicho mamífero transgénico no humano es una cabra, una vaca, una oveja, un caballo o un primate no humano.

22. Planta o animal transgénico no humano que expresa al menos un anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.