SUSTANCIA QUE SE UNE AL RECEPTOR HUMANO llb MEDIANTE Fc DE IgG (Fc Rllb).

Sustancia que se une al receptor humano IIb mediante Fc de IgG (FcRIIb) La invención se refiere a nuevos inmunógenos que poseen epítopos conformacionalmente discriminadores (CDEs), y a métodos de inmunización para producir anticuerpos que reconocen específicamente proteínas con homólogos muy estrechamente relacionados. En particular, la invención se refiere a anticuerpos que son específicos para FcRIIb y que son útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, infecciones, tumores y otras afecciones en las que está implicado el sistema inmunitario. Los receptores de Fc (FcRs) desempeñan un papel clave a la hora de defender al organismo humano frente a infecciones. Después de que los patógenos tienen acceso a la circulación sanguínea, son opsonizados por los anticuerpos (inmunoglobulinas, Igs). Esto conduce a la formación de complejos inmunitarios. Las porciones Fc de los anticuerpos se pueden unir a receptores de Fc que están presentes en virtualmente todas las células del sistema inmunitario. Existen FcRs específicos para todas las clases de Ig. La letra griega indica la clase de Ig a la que se une, es decir, los receptores de Fc reconocen IgG, etc. Desde hace años se conoce que los receptores de Fc para IgG (FcR) desempeñan un papel importante a la hora de accionar respuestas efectoras (Metzger, 1992A). Estas incluyen, dependiendo del FcR expresado y del tipo celular, endo- y fagocitosis que dan como resultado la neutralización de los patógenos y la presentación de antígenos, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), activación de neutrófilos, regulación de la producción de anticuerpos, o la secreción de mediadores inflamatorios (Fridman et al., 1992; van de Winker y Capel, 1993; Ravetch y Bolland, 2001). En contraste con el papel beneficioso que los FcRs desempeñan en el individuo sano, también transmiten la estimulación del sistema inmunitario en alergias (por ejemplo, mediadas por FcR1a) o enfermedades autoinmunitarias. Además, algunos virus emplean los FcRs para tener acceso a las células, como el VIH (Homsy et al., 1989) y el Dengue (Littaua et al., 1990), o ralentizan la respuesta inmunitaria bloqueando los FcRs, como en el caso del Ébola (Yang et al., 1998) y del sarampión (Ravanel et al., 1997). Los receptores de Fc para IgG (FcR) son los más ampliamente extendidos de la familia de receptores de Fc, y se expresan en un patrón definido en todas las células activas inmunológicas. FcRI se expresa constitutivamente en monocitos y macrófagos, y puede ser inducido en neutrófilos y eosinófilos. El papel fisiológico de FcRI todavía es desconocido, ya que la expresión en monocitos no es vital (Ceuppens et al., 1988). La forma anclada a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de FcRIII (FcRIIIb) se expresa exclusivamente en granulocitos. Debido a su parte citoplásmica faltante, la transducción de señales en la célula se produce solamente vía otras proteínas transmembránicas, como el receptor del complemento tipo 3 (CR3), que se pueden asociar al menos con FcRIIIb (Zhou et al., 1993; Poo et al., 1995). FcRIIIa se expresa principalmente en monocitos y macrófagos, pero sólo junto con una proteína asociada denominada cadena . FcRIIa es el receptor con la distribución más amplia en las células inmunocompetentes, y está implicado principalmente en la endocitosis de complejos inmunitarios. FcRIIb se expresa en células B, en las que es el único receptor de IgG, y en células efectoras tales como macrófagos, neutrófilos y mastocitos, pero no en células NK ni en células T. Estructuralmente, la parte extracelular de los FcRs consiste en tres (FcRI, CD64) o dos (FcRI, FcRII, CD32 y FcRIII, CD16) dominios similares a Ig (aprox. 10 kDa/dominio), y por lo tanto pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. Además de los dominios extracelulares, los FcRs tienen un dominio transmembránico, y un dominio intracelular, con la excepción del FcRIIIb anclado a GPI. Los receptores son homólogos entre sí, y la identidad global en la secuencia de aminoácidos entre los FcRs y el FcRIa supera el 40% en sus regiones extracelulares. FcRIIa y FcRIIb difieren en su región extracelular en sólo 6% de los restos de aminoácidos. No obstante, ambas formas se pueden distinguir por sus características de unión a las subclases de IgG humana y de ratón (van de Winkel y Capel, 1993) y su distinta afinidad hacia IgGs humanas (Sondermann et al., 1999A). Los FcRs están muy glucosilados. La secuencia de ADNc de muchos receptores de Fc es conocida, y se han generado algunos FcR recombinantes solubles. Los receptores de Fc recombinantes solubles, que se caracterizan por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, se describen en el documento WO 00/32767. El documento WO 00/32767 describe polipéptidos de FcRIIb solubles que comprenden el motivo de aminoácido RGTH, que corresponde a los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcRIIb según la presente invención. El documento WO 00/32767 describe además el uso del polipéptido de FcRIIb soluble para la identificación de sustancias que son capaces de actuar como inhibidores del reconocimiento y unión de anticuerpos a los receptores celulares respectivos. 2   Los FcRs aparecen en diversas isoformas (FcRIa, b1, b2, c; FcRIIa1-2, b1-3, c) y alelos (FcRIIa1-HR, -LR; FcRIIIb-NA1, -NA2) (van de Winkel y Capel, 1993). En contraste con las partes extracelulares homólogas globales, los dominios transmembránicos y citoplásmicos de hasta 8 kDa difieren enormemente. Los FcRs se pueden dividir en dos clases generales según su función, que puede ser activadora o inhibidora. Los receptores activadores están asociados con un motivo de activación a base de tirosina del inmunorreceptor (ITAM) de 16 aminoácidos que tiene la secuencia de consenso Y-X2-L/I-X8-Y-X2-L/I (Isakov, 1997). Este motivo se puede encontrar, por ejemplo, en FcRIIa. La otra clase de FcRs son los receptores inhibidores, que tienen un motivo inhibidor (ITIM) citoplásmico de 6 aminoácidos que tiene la secuencia de consenso V/I-X-Y-X2-V/L (Isakov, 1997). Un ejemplo de tal FcR inhibidor es FcRIIb. La activación e inhibición vía los motivos ITAM e ITIM se efectúan mediante fosforilación de la tirosina. Dependiendo del tipo celular particular, activadas por el receptor de Fc, diferentes tirosina cinasas están implicadas en estas rutas de señalización (Amigorena et al., 1992). Tanto los FcRs activadores como inhibidores se pueden expresar en la misma célula, lo que permite el funcionamiento de los receptores activadores e inhibidores en concierto para un ajuste fino de la respuesta inmunitaria. FcRIIb tiene dos actividades inhibidoras. Una de estas depende del motivo ITIM, y se produce cuando FcRIIb se liga a un receptor que tiene ITAM (por ejemplo FcRIIa), dando como resultado la inhibición de la movilización del calcio accionada por ITAM y la proliferación celular. Esto significa que los procesos dependientes del calcio, tales como desgranulación, fagocitosis, ADCC, liberación de citocinas, y activación proinflamatoria, y también la proliferación de células B son bloqueados por FcRIIb. La segunda actividad inhibidora de FcRIIb implica la homoagregación del receptor (agrupamiento de FcRIIb), que envía una señal proapoptótica al citoplasma. La señal proapoptótica sólo se ha dado a conocer en células B, y se puede bloquear por ligación de FcRIIb al receptor de células B (BCR). Estudios in vivo sugieren que FcRIIb desempeña un papel en la tolerancia periférica, debido a que los ratones a los que se les ha desactivado FcRIIb desarrollan espontáneamente enfermedades autoinmunitarias. Por otro lado, también se ha dado a conocer que FcRIIb disminuye la citotoxicidad frente a tumores (Clynes et al., 2000). Los ratones deficientes en FcRIIb y tratados con un anticuerpo antitumoral mostraron ADCC aumentada, dando como resultado la reducción de la metástasis tumoral, mientras que los ratones deficientes en receptores de Fc activadores fueron incapaces de detener el crecimiento tumoral, cuando se trataron con el mismo anticuerpo. La generación de anticuerpos inmunizando animales con proteínas o péptidos como inmunógenos es conocida en la técnica. Los protocolos de inmunización convencionales usan péptidos lineales como inmunógenos, que derivan de antígenos de interés. La desventaja de tales métodos es que, debido a que la estructura tridimensional de los epítopos se pierde completamente a menudo, los anticuerpos resultantes no son muy específicos, o comprenden una gran fracción de anticuerpos dirigidos a epítopos distintos de aquél de interés. Durante la última década, los protocolos de inmunización que usan células que expresan receptores de Fc, o que usan receptores de Fc desnaturalizados, sólo han dado como resultado anticuerpos que fueron capaces... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a FcRIIb humano en el entorno natural del receptor de Fc a través de su región variable, y que se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que comprende un epítopo conformacionalmente discriminador (CDE) que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos. 2. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que se une con una afinidad al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 100 veces, más preferiblemente al menos 1.000 veces, más preferiblemente al menos 10.000 veces, más preferiblemente al menos 100.000 veces, más preferiblemente al menos 1.000.000 veces mayor por FcRIIb que por FcRIIa. 3. El anticuerpo o fragmento del mismo de las reivindicaciones 1 ó 2, que no interfiere con la unión del complejo inmunitario a FcRIIb. 4. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es capaz de activar la función fisiológica de FcRIIb humano. 5. El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es capaz de reticular específicamente FcRIIb humano. 6. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que aparece en un estado monómero o multímero. 7. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es de la clase IgG, IgE, IgM o IgA. 8. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se selecciona de anticuerpos monocatenarios, anticuerpos bifuncionales y anticuerpos trifuncionales, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, fragmentos Fv y fragmentos scv. 9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10. Un vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9. 11. Una célula hospedante transfectada con un vector según la reivindicación 10. 12. Uso de un péptido que comprende un CDE de FcRIIb, que contiene los aminoácidos 27 a 30 de FcRIIb según SEC ID NO. 2, y que tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos, para identificar librerías moleculares para moléculas de unión o librerías genéticamente codificadas para encontrar sustancias que se unen específicamente a FcRIIb. 13. Uso según la reivindicación 12, en el que las librerías comprenden péptidos, moléculas orgánicas, peptidomiméticos, o dominios variables de anticuerpos. 14. Uso según la reivindicación 12, para identificar librerías de moléculas que se unen específicamente a FcRIIb en células humanas. 15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido se estabiliza estructuralmente mediante circularización. 16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido comprende aminoácidos artificiales o/y glucosilados. 17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido está conjugado a una molécula portadora. 18. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende inmunizar animales o animales transgénicos con un péptido o polipéptido artificial en su conformación nativa, en el que el péptido o polipéptido comprende un CDE que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos, y en el que el CDE está estandarizado estructuralmente mediante circularización. 19. El método según la reivindicación 18, en el que el péptido o polipéptido comprende aminoácidos artificiales o/y glucosilados. 22   20. El método según la reivindicación 18 ó 19, en el que el péptido o polipéptido está conjugado a una molécula portadora. 21. Una composición farmacéutica y/o de diagnóstico útil para el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades asociadas con la señalización mediada por el receptor de Fc, en particular artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, psoriasis o lupus eritematoso, que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y sustancias portadoras farmacéuticamente aceptables. 22. Un kit de diagnóstico para la detección de enfermedades autoinmunitarias y/o cáncer, que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 23. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de inhibidores o activadores de la interacción FcRIIb/IgG. 24. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, púrpura trombocitopénica inmunitaria, o esclerosis múltiple. 25. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de cáncer, en particular linfomas o leucemias. 26. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de un adyuvante con otros compuestos bioterapéuticos para el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer. 27. Uso de la reivindicación 26, en el que los otros compuestos terapéuticos se seleccionan del grupo que comprende los anticuerpos Herceptin®, Rituxan®, IC14, PANOREX, IMC-225, VITAXIN, Campath 1H/LDP-03, LYMPHOCIDE y ZEVLIN, y anticuerpos que se unen a los siguientes antígenos de cáncer: MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa, p15, beta-catenina, MUM-1, CDK-4, HER- 2/neu, papilomavirus E6 humano, papilomavirus E7 humano y MUC-1. 28. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias. 29. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades asociadas con células dendríticas y/o macrófagos activados. 30. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedad de hospedante frente a injerto. 31. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades relacionadas con amiloides. 32. Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica para incrementar el efecto de la vacunación. 33. Anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se modifica en el fragmento de Fc mediante la modificación de la glucosilación y/o mutagénesis para potenciar la unión hacia subconjuntos de los receptores de Fc. 23   24     26   27   28   29