Un polipéptido compuesto por (i) una secuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC.

ID. Nº: 3, (ii) unasecuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC. ID. Nº: 5, la SEC. ID. Nº: 6 o la SEC. ID. Nº: 7, o (iii) unavariante de (i) o (ii) que tiene al menos un 80% de identidad de la secuencia con una de esas secuencias, donde elpolipéptido tiene la capacidad de unirse a RANKL y donde el polipéptido inhibe la diferenciación de las célulasprogenitoras de los osteoclastos, para su uso en el tratamiento de un sujeto con una afección de los huesoscaracterizada por la reabsorción ósea no deseada, como la artritis reumatoide, las metástasis osteolíticas o elmieloma múltiple, mediante la administración del polipéptido, donde el polipéptido no tiene la secuencia para la SARP-2 humana, con alanina en la posición 174, Uniprot ID nº Q8N474y.

sFRP y motivos peptídicos que interactúan con sFRP y sus métodos de uso.

La divulgación se refiere a la diferenciación de osteoclastos, concretamente a un motivo peptídico y proteínas que contienen el motivo, que son capaces de unirse a miembros de la familia de las proteínas secretadas relacionadas con el receptor Frizzled.

ANTECEDENTES

La remodelación ósea, un proceso responsable de la constante renovación del esqueleto humano adulto, es tarea de los osteoclastos y osteoblastos, dos tipos de células especializadas que se originan a partir de progenitores hematopoyéticos y mesenquimales de la médula ósea, respectivamente. El suministro constante y ordenado de estas células resulta fundamental para la homeostasis esquelética, dado que una producción incrementada o reducida de osteoclastos u osteoblastos y/o los cambios en el ritmo de su apóptosis son en gran parte responsables del desequilibrio entre la formación y la reabsorción de hueso que explica diversas enfermedades de huesos sistémicas o localizadas.

Una actividad intensificada de los osteoclastos desempeña un papel fundamental en la patogénesis de la osteoporosis postmenopáusica, la enfermedad de Paget, metástasis osteolíticas, mieloma múltiple, hiperparatiroidismo, artritis reumatoide, periodontitis e hipercalcemia de malignidad. Estos problemas clínicos están asociados con una importante morbididad o mortalidad y afectan a más de 10 millones de pacientes en los Estados Unidos. Sin embargo, solamente se dispone de un número limitado de agentes que inhiben la formación de osteoclastos o la reabsorción ósea y, en la mayoría de los casos, se desconocen sus mecanismos de acción. Por otra parte, muchos de estos agentes tienen importantes efectos secundarios que limitan su utilidad. Por tanto, existe la necesidad de identificar y caracterizar los inhibidores de la formación de osteoclastos y reabsorción ósea, como parte de la constante búsqueda para ofrecer beneficios terapéuticos a estos pacientes.

Por lo contrario, el descenso de la actividad de los osteoclastos desempeña un importante papel en la patogénesis de la osteopetrosis, la osteodistrofia de Albright y la acondroplasia, para las que no existe una terapia específica. Por tanto, también existe la necesidad de identificar y caracterizar los tratamientos que intensifican la formación de osteoclastos y la reabsorción ósea, a fin de proporcionar terapias útiles para estos pacientes.

La identificación de los mecanismos implicados en los trastornos óseos es fundamental para entender la fisiología de los huesos. A pesar de que se han identificado y clonado numerosos genes y familias de genes (y los polipéptidos que estos codifican) que participan en la regulación de las células óseas, sus funciones todavía no se han definido con claridad, debido a las complejidades que presentan las vías de formación del hueso. Existe una gran necesidad de realizar una identificación definitiva de los objetivos para el tratamiento de los trastornos óseos, incluyendo los trastornos de reabsorción ósea, como la osteoporosis postmenopáusica, la enfermedad de Paget, las metástasis osteolíticas, el mieloma múltiple, la artritis reumatoide, la hipercalcemia de malignidad, la osteopetrosis, la osteodistrofia de Albright y la acondroplasia.

WO01/19855A divulga el concepto general de las SFRP y las composiciones farmacéuticas Baranski et al, Developmental Biology, vol 217, nº 1 (2000) páginas 25-41 se refiere a los patrones de expresión -

Hausler et al, Bone, vol 27, nº 4 (2000) página Rattner et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, vol 94, nº 7 (1997) páginas 2859-2863, se refiere a una familia de proteínas secretadas que contienen homología con los receptores Frizzled.

Hijikata et al, FEBS, vol 457, nº 3 (1999) páginas 405-408 se refiere a la introducción de apóptosis de las células de la línea monocito-macrófago.

Van Der Pluijm et al, Journal of Bone and Mineral Research, vol 9, Nº 7 (1994) páginas 1021-1028, se refiere a las integrinas y a la reabsorción osteoclástica en tres cultivos de órganos óseos.

RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

En el presente se divulgan proteínas que se unen a la proteína secretada relacionada con el receptor Frizzled-1 (sFRP-1) . En una realización, el péptido de unión de sFRP-1 es un péptido purificado.

En otra realización, se divulga un método para intensificar la diferenciación de osteoclastos. En un ejemplo específico, no limitador, el método incluye la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de los péptidos purificados divulgados en el presente (o fragmentos, fusiones o miméticos efectivos) a un sujeto, a fin de intensificar la diferenciación de osteoclastos.

En otra realización, se proporciona un método para inhibir la formación de osteoclastos en un sujeto. El método fragmentos de SEC. ID. Nº: 3, o fusiones o variantes de SEC. ID. Nº: 3, a un sujeto, donde el polipéptido se une a una molécula de RANKL, identificada con el número de acceso GenBank AF

En otra realización más, se proporciona un método para modular la actividad de las células T. En un ejemplo específico, no limitador, el método incluye la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de los péptidos de unión a sFRP-1 purificados divulgados en el presente, con el fin de modular la actividad de las células T.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

El polipéptido no tiene la secuencia para la SARP-2 humana, divulgada en Melcomyant et al., 1997, Proc. Natl. Aad Sei. USA, 94, 13636 – 13641, con alanina en la posición 174 (Uni Prot IDNo.Q8N474) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1 es una gráfica que muestra el resultado de la unión de la proteína de fusión A-C2 (SEC. ID. Nº: 14) /AP (fosfatasa alcalina) a sFRp-1 (SEC. ID. Nº: 3) . Se incubaron caldos de colonias bacterianas separadas infectadas con fagos que expresan la quimera A-C2/AP en pocillos ELISA recubiertos de sFRP-1 (y posteriormente se -1, 1-2, 1-6, 1-12, 1-13 and 1-14) contenía actividad de AP, medida mediante reacción con pNPP y desarrollo de color a 405 nm, que se unía específicamente a los pocillos recubiertos de sFRP-1 (SEC. ID. Nº: 3) (barras grises) en comparación con los pocillos recubiertos solamente con BSA (barras negras) . Cada muestra se testó individualmente; esto es representativo de varios experimentos.

FIG. 2 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de unión competitivo de A-C2/AP (SEC. ID. Nº: 14) y

- C2/AP antes de añadirlos a los pocillos ELISA recubiertos de sFRP-1 (A-C2 cuadrados abiertos y A-F7 rombos abiertos) o BSA (A-C2 círculos abiertos y A-F7 triángulos abiertos) . Las muestras se testaron por triplicado y los resultados se muestran como la media +/- SD. Esto es representativo de los tres experimentos.

FIG. 3 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos de unión de proteínas de fusión de A-C2 (SEC. ID. Nº: 14) /fosfatasa alcalina con alanina sustituida a sFRP-1 (SEC. ID. Nº: 3) en un ELISA. La gráfica de barras indica la media +/- S.D. de mediciones por triplicado de un único experimento representativo. Un análisis paralelo de estas muestras en pocillos recubiertos con anticuerpo monoclonal para el epítopo FLAG indicó que la concentración de quimera en los diferentes caldos era similar.

FIG. 4 es un conjunto de diagramas que muestran un análisis calorimétrico de la interacción entre el péptido AC2 y sFRP-1. La FIG. 4 es un seguimiento y muestreo que indica el calor generado cuando se añadieron partes alícuotas de una solución de AC2 a una cámara que contenía sFRP-1 disuelta en PBS. La FIG. 4 es un seguimiento y muestreo del calor generado en el control de PBS correspondiente. Basándose en la cantidad de calor liberado, se calcularon diversos parámetros de la reacción de unión, incluyendo la entalpía (ΔH) y la constante de disociación (Kd) .

FIG. 5

- -1, y el símbolo má

FIG. 6 es un conjunto de gráficas que muestra que la sFRP-1 inhibe la formación de osteoclastos en dos modelos experimentales diferentes. La FIG. 6A es una gráfica que muestra los resultados de experimentos de cocultivo en los

- Posteriormente, los pocillos fueron teñidos para determinar el número de células multinucleadas (MNC)

Los resultados demuestran que a medida que la concentración... [Seguir leyendo]

Un polipéptido compuesto por (i) una secuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC. ID. Nº: 3, (ii) una secuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC. ID. Nº: 5, la SEC. ID. Nº: 6 o la SEC. ID. Nº: 7, o (iii) una variante de (i) o (ii) que tiene al menos un 80% de identidad de la secuencia con una de esas secuencias, donde el polipéptido tiene la capacidad de unirse a RANKL y donde el polipéptido inhibe la diferenciación de las células 5 progenitoras de los osteoclastos, para su uso en el tratamiento de un sujeto con una afección de los huesos caracterizada por la reabsorción ósea no deseada, como la artritis reumatoide, las metástasis osteolíticas o el mieloma múltiple, mediante la administración del polipéptido, donde el polipéptido no tiene la secuencia para la -Uniprot ID nº Q8 10 para su uso en el tratamiento de un sujeto con una afección de huesos caracterizada por la reabsorción ósea no deseada, como la artritis reumatoide, las metástasis osteolíticas o el osteoclastos con un polipéptido compuesto por (i) una secuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC. ID. Nº: 3, (ii) una secuencia de aminoácidos como la recogida en la SEC. ID. Nº: 5, la SEC. ID. Nº: 6 o la SEC. ID. Nº: 7, o (iii) una variante de (i) o (ii) que tiene al menos un 80% de identidad de la secuencia con una de esas secuencias, donde el polipéptido no tiene la secuencia para la SARP-2 humana, con la alanina en