Virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 o rDEN2Δ30 atenuado que contiene una deleción de 30 nucleótidos (Δ

30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue tipo 1 ó 2, en el que dicha deleción de 30 nucleótidos corresponde a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10562-10591 para el dengue tipo 1 y a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10541-10570 para el dengue tipo 2

Vacuna contra el dengue que contiene una deleción común de 30 nucleótidos en la UTR en 3' del dengue tipos 1 y 2.

Campo de la invención

La invención se refiere a una vacuna contra el virus del dengue que contiene una deleción común de 30 nucleótidos (Δ30) en la región no traducida en 3' del genoma del virus del dengue serotipos 1 y 2.

Antecedentes de la invención

El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue está ampliamente distribuido por todas las regiones tropicales y semitropicales del mundo y se transmite a seres humanos por vectores de mosquitos. El virus del dengue es una causa importante de hospitalización y muerte en niños en al menos ocho países asiáticos tropicales (OMS 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2ª edición, Ginebra). Hay cuatro serotipos de virus del dengue (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) que provocan anualmente unos 50-100 millones de casos estimados de fiebre del dengue y 500.000 casos de la forma más grave de infección por virus del dengue conocida como fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (FHD/SCD) (Gubler, D.J. y Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). Esta última enfermedad se observa predominantemente en niños y adultos que experimentan una segunda infección por virus del dengue con un serotipo diferente del de su primera infección por virus del dengue y en infección primaria de lactantes que todavía tienen anticuerpo materno específico del dengue circulante (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-180; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-575). Es necesaria una vacuna contra el dengue para atenuar la carga de la enfermedad provocada por el virus del dengue, pero no se ha autorizado ninguna. Debido a la asociación de una enfermedad más grave con la infección por virus del dengue secundaria, una vacuna satisfactoria debe inducir simultáneamente inmunidad para los cuatros serotipos. La inmunidad está mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glicoproteína de la envuelta (E), una proteína estructural del virión. La infección con un serotipo induce inmunidad homotípica de larga duración y una inmunidad heterotípica de corta duración (Sabin, A. 1955 Am J Trop Med Hyg 4:198-207). Por tanto, el objetivo de la inmunización es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4, lo que puede lograrse de la mejor manera desde el punto de vista económico usando vacunas de virus atenuados vivos. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna atenuada viva para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. y Heinz, F.X. 1996 en: Fields Virology, Fields, D.M et al. eds. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, págs. 961-1034).

Se han desarrollado varios candidatos a vacuna contra el dengue atenuada viva y se han evaluado en seres humanos y primates no humanos. Los primeros candidatos a vacuna contra el dengue atenuada viva fueron mutantes de espectro de huéspedes desarrollados mediante pase en serie de virus del dengue de tipo natural en los cerebros de ratones y selección de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. y Hotta, S. 1944 Jpn J Bacteriol 1:96-99; Sabin, A.B. y Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisserman, C.L. et al. 1963 Am J Trop Med Hyg 12:620-623). Aunque estos virus candidatos a vacuna eran inmunogénicos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular desaconsejó el desarrollo adicional. Se han desarrollado candidatos a vacuna de DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 atenuada viva mediante pase en serie en cultivo de tejido no humano (Angsubhakom, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-559; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-195; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33: 684-698; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-226; Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188) o mediante mutagénesis química (McKee, K.T. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-442). Se ha comprobado que es muy difícil lograr un equilibrio satisfactorio entre atenuación e inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e inmunogénica de manera satisfactoria contra cada uno de los cuatros virus del dengue (Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188; Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-47).

Dos importantes avances usando tecnología de ADN recombinante han hecho posible recientemente desarrollar candidatos a vacuna contra virus del dengue atenuada viva prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado métodos para recuperar virus del dengue infeccioso a partir de células transfectadas con transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo así posible derivar virus infecciosos que portan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc mediante mutagénesis dirigida al sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-5143). En segundo lugar, es posible producir virus quiméricos antigénicos en los que la región que codifica para proteínas estructurales del clon de ADNc de longitud completa del virus del dengue se reemplaza por la de un serotipo de virus del dengue diferente o de un flavivirus más divergente (Bray, M. y Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-10346; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-5190; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-3028; Pletnev, A.G. y Men, R 1998 PNAS USA 95:1746-1751). Se han usado estas técnicas para construir virus del dengue quiméricos intertípicos que han mostrado ser eficaces en la protección de monos frente a la exposición a virus del dengue homólogo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-4166). También está usándose una estrategia similar para desarrollar vacunas contra virus del dengue quiméricas antigénicas atenuadas basándose en la atenuación del virus de la vacuna contra la fiebre amarilla o la atenuación de virus del dengue sometidos a pase en cultivo celular (Monath, T.P. et al. 1999 Vacuna 17:1869-1882; Huang, C.Y. et al. 2000 J. Virol 74:3020-3028).

Otro estudio examinó el nivel de atenuación para seres humanos de un mutante de DEN4 que portaba una deleción de 30 nucleótidos (Δ30) introducida en su región no traducida en 3' mediante mutagénesis dirigida al sitio y que se encontró previamente que estaba atenuado para monos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-3937). Se llevaron a cabo estudios adicionales para examinar si esta mutación Δ30 presente en el candidato a vacuna DEN4 era el determinante principal de su atenuación para monos. Se encontró que la mutación Δ30 era de hecho el determinante principal de la atenuación para monos, y que especificaba un equilibrio satisfactorio entre atenuación e inmunogenicidad para seres humanos (Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:405-13).

Sumario de la invención

La mutación atenuante Δ30 previamente identificada, creada en el virus del dengue tipo 4 (DEN4) mediante la eliminación de 30 nucleótidos de la UTR en 3', también puede atenuar una cepa de tipo natural del virus del dengue tipo 1 (DEN1). La eliminación de 30 nucleótidos de la UTR en 3' de DEN1 en una región altamente conservada homóloga a la región de DEN4 que abarca la mutación Δ30 produjo un virus recombinante atenuado en monos rhesus en un nivel similar al virus recombinante DEN4Δ30. Esto establece la transportabilidad de la mutación Δ30 y su fenotipo de atenuación para un tipo de virus del dengue distinto de DEN4. La transferibilidad eficaz de la mutación Δ30, descrita en este trabajo, establece la utilidad de la mutación Δ30 para atenuar y mejorar la seguridad de vacunas contra el virus del dengue comercializables de serotipo 1 y 2. Se prevé una vacuna contra el virus del dengue tetravalente que contiene virus del dengue tipos 1, 2, 3 y 4, cada uno atenuado mediante la mutación Δ30. Se prevé también una vacuna contra el virus del dengue tetravalente que contiene virus quiméricos antigénicos recombinantes en los que los genes estructurales...

1. Virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 o rDEN2Δ30 atenuado que contiene una deleción de 30 nucleótidos (Δ30) en una sección de la región no traducida en 3' del genoma del dengue tipo 1 ó 2, en el que dicha deleción de 30 nucleótidos corresponde a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10562-10591 para el dengue tipo 1 y a la estructura de tallo-bucle TL2 entre los nucleótidos 10541-10570 para el dengue tipo 2.

2. Virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 atenuado o rDEN2Δ30 atenuado según la reivindicación 1, que comprende además una mutación que confiere un fenotipo, siendo el fenotipo sensibilidad a la temperatura en células Vero o la línea celular hepática humana HuH-7, restricción de célula huésped en células de mosquito o la línea celular hepática humana HuH-7, adaptación a célula huésped para la replicación mejorada en células Vero, o atenuación en ratones o monos.

3. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 atenuado o rDEN2Δ30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacéutica para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora.

4. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 atenuado o rDEN2Δ30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una vacuna que va a administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria protectora.

5. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 atenuado o rDEN2Δ30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención de una enfermedad provocada por el virus del dengue.

6. Uso del virus del dengue recombinante rDEN1Δ30 atenuado o rDEN2Δ30 atenuado según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una vacuna que va a administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para prevenir una enfermedad provocada por el virus del dengue.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el sujeto es un ser humano.