Nuevos agentes de unión a OX40R.

Un agente de unión a OX40R que es la secuencia del péptido correspondiente a los aminoácidos 94-124 deOX40L humano y que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

Nuevos agentes de unión a OX40R

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos capaces de modular las interacciones entre el receptor OX40 y el ligando de OX40.

Antecedentes de la invención

El sistema regulador de las células constituido por las proteínas de membrana del receptor OX40 (indicado también en la bibliografía como OX40R, OX-40, antígeno OX-40, TNFRSF4 o CD134) y del ligando OX40 (indicado también en la bibliografía como OX40L, glicoproteína gp34, ACT-4-L, TNFSF4, ligando CD134 o CD134L) tiene un papel importante en la regulación de las respuestas inmunes, así como en la formación de tejido linfoide secundario, al igual que otras proteínas que pertenecen a las superfamilias de ligando/receptor del factor de necrosis tumoral (Gravestein L y Borst J, 1998; Weinberg A, 2002) . Muchas evidencias de estas actividades han sido proporcionadas por observaciones clínicas y por modelos animales, por ejemplo, mediante experimentos que se dirigen hacia un gen (Chen A y col., 1999; Kopf M y col., 1999; Murata K y col., 2000) .

El receptor OX40 (OX40R, a partir de ahora) es un antígeno de la superficie celular, miembro de la familia de TNFR, expresado de forma transitoria después del acoplamiento del receptor de linfocitos T (TCR) y que actúa como un receptor coestimulador. Se considera un marcador muy especifico de la activación de CD4+ o CD8+ para los linfocitos T, el cual se hiperexpresa frecuentemente en sitios de inflamación asociados a patologías inmunológicas, tal como en la esclerosis múltiple o la artritis reumatoide, así como en linfocitos de infiltración tumoral y en la sangre periférica de modelos animales de la enfermedad de injerto contra hospedador.

El ligando OX40 (OX40L, a partir de ahora) es una proteína transmembranal, identificada originalmente como una proteína estimulada por la infección con virus 1 linfotrópico de linfocitos T humanos y la activación de CD40 (Miura S y col., 1991) , tiene una estructura similar a TNF y es capaz de formar trímeros unidos a la célula o secretados. Está presente en linfocitos B y T activados, presentadores de antígeno, así como en células dendríticas, células del endotelio vascular y otros tejidos no hematopoyéticos (por ejemplo el corazón, el músculo esquelético y el páncreas) .

OX40L interacciona con OX40R como un homotrímero con una alta afinidad (Kd = 0, 2-0, 4 nM) , y se han analizado varios ensayos de la unión, sobre este sistema (Taylor L y col., 2002; Taylor L y Schwartz H, 2001; Al-Shamkhani A y col., 1997) . Sin embargo, hasta la fecha no se ha determinado la estructura tridimensional, ni se han realizado estudios detallados de la estructura y la actividad, con el fin de proporcionar más detalles moleculares sobre el mecanismo de la interacción de OX40L-OX40R.

La interacción entre OX40L y OX40R tiene un efecto coestimulador para los linfocitos T efectores que expresan OX40R, dando lugar a una respuesta celular más vigorosa debido al aumento de la producción de citocinas a través de los linfocitos T cooperadores (Th1 y Th2) y a un incremento de la supervivencia de las linfocitos T de memoria, a través de la inhibición de la muerte celular inducida por activación. Evidencias que lo confirman también se obtuvieron en ratones transgénicos que carecen de un gen funcional de OX40L y en modelos animales de autoinmunidad, en donde se mostró que el bloqueo de la interacción OX40R-OX40L o el agotamiento de los linfocitos T positivos para OX40R, reduce los signos clínicos de autoinmunidad.

Por otra parte, OX40L induce, después de unirse a OX40R, la expresión de varios genes, incluyendo las quimiocinas C-C RANTES, lo que confirma los resultados obtenidos en modelos de endotelio, en donde el sistema OX40R-OX40L aparece involucrado en el control de la extravasación activada de linfocitos T (Kotani A y col., 2002) .

En conjunto, estos datos de la expresión y funcionales plantean la posibilidad de que las vías de transducción de señales reguladas por las interacciones de OX40L-OX40R, pueden ayudar a prolongar las respuestas proliferativas específicas de antígeno, o influir de otro modo en la persistencia, la diferenciación o la reactivación de poblaciones de linfocitos T efectores/de memoria.

El interés en el sistema OX40R-OX40L se relaciona con el hecho de que, aunque los mecanismos de señalización intracelulares aún no se han entendido completamente, el perfil de expresión de OX40R vuelve a esta proteína un objetivo peculiar para las enfermedades mediadas por linfocitos T CD4+ en el ámbito clínico, por ejemplo en la esclerosis múltiple, en donde es necesario eliminar los linfocitos T autorreactivos. La hipótesis es que los productos que modulan la actividad de OX40R puede que no tengan los efectos secundarios graves de terapias inmunosupresoras convencionales para enfermedades autoinmunes y el rechazo de trasplantes, que se dirigen a todos los linfocitos T.

El potencial terapéutico de la modulación de la interacción entre OX40L y OX40R fue reconocido por los resultados generados in vivo, obtenidos con inmunotoxinas dirigidas contra OX40L (Weinberg A y col., 1996) , anticuerpos anti-OX40R (Bansal-Pakala P y col., 2001) , anticuerpos anti-OX40L (Stuber E y Strober W, 1996; Yoshioka Y y col. 2000; Tsukada N y col., 2000) , y las proteínas de fusión OX40L-Ig (Higgins LM y col., 1999; Weinberg A y col., 1999) . Estos compuestos están pensados para ser antagonistas de la interacción entre OX40L-OX40R (para evitar la acumu

lación de linfocitos T CD4+ activados, en los sitios de inflamación) o para activar OX40R (como en algunos otros estados patológicos, como el cáncer) .

Diversos agentes de unión a OX40R, ya sean agonistas o antagonistas de OX40R, han sido descritos en la técnica anterior por sus efectos positivos sobre la inmunización y el tratamiento del cáncer (documentos de patentes WO 95/21915; WO 95/21251; EP 978287; WO 99/42585; WO 02/66044; EE.UU. 6312700) . Sin embargo, sólo moléculas de gran tamaño, tales como el dominio extracelular completo de OX40L o anticuerpos, se describen en realidad por ser agentes de unión a OX40R eficaces. Esto se debe también al hecho de que no se han realizado estudios serios sobre la estructura-actividad, para caracterizar esta interacción, ni se puede deducir una información fiable a partir del análisis de otras estructuras proteicas de TNF/TNFR (Bodmer JL y col., 2002) .

Desde que se conoce que los agentes de unión a OX40R han mostrado ser útiles como agentes terapéuticos y de diagnóstico, sería deseable identificar compuestos que, manteniendo las propiedades de unión y de competencia con OX40L de las moléculas grandes antes mencionadas, sean más fáciles de generar y formular como péptidos u otras moléculas pequeñas.

Sumario de la invención

Ahora se ha descubierto que péptidos específicos obtenidos a partir del dominio extracelular de OX40L, se pueden utilizar como agentes de unión a OX40R. Más específicamente, se ha encontrado que un péptido correspondiente a los aminoácidos 94-124 de OX40L humano, así como fragmentos de este péptido que comprenden los aminoácidos 107-116 de OX40L humano, interaccionan con OX40R humano con alta afinidad, tal y como se muestra con dos tecnologías de escrutinio diferentes y fiables. Tales péptidos, las proteínas heterólogas que comprenden sus secuencias, así como péptidos y otras moléculas diseñadas basándose en sus secuencias, se pueden utilizar como agentes de unión a OX40R que compiten con OX40L natural para diferentes usos terapéuticos. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción de las Figuras

Figura 1: Diseño experimental del ensayo AlphaScreen® desarrollado inicialmente para demostrar la viabilidad de este enfoque para el estudio de la interacción entre OX40L-OX40R.

Figura 2: Unión dependiente de la dosis de OX40L-CD8 a OX40R-IgG1, tal y como se detecta empleando el ensayo AlphaScreen®. (A) Concentraciones en aumento de OX40L-CD8 se incubaron con OX40R-IgG1, a una concentración de 5 nM (º) o 10 nM (º) durante 30 minutos. A continuación se añadió el anticuerpo anti-CD8 biotinilado (10 nM) y 30 minutos más tarde, se añadieron perlas donantes de estreptavidina (20 mg/ml) y aceptoras de proteína A (20 mg/ml) . Una hora después de estas incorporaciones, se hizo un recuento de la... [Seguir leyendo]

1. Un agente de unión a OX40R que es la secuencia del péptido correspondiente a los aminoácido.

9. 124 de OX40L humano y que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

2. Un agente de unión a OX40R que es un fragmento peptídico de los aminoácido.

9. 124 de OX40L humano que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, en donde dicho fragmento comprende los aminoácido.

10. 116 de OX40L humano que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

3. El agente de unión a OX40R de acuerdo con la reivindicación 2, que se corresponde a los aminoácido.

10. 116 de OX40L humano que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

4. Un agente de unión a OX40R que es la secuencia peptídica que se corresponde a los aminoácido.

10. 111 de OX40L humano y que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

5. El agente de unión a OX40R que es un mutante activo de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno o varios de sus aminoácidos están sustituidos de forma conservadora y en donde dicho mutante activo se une a OX40R.

6. Un agente de unión a OX40R que es un polipéptido de fusión que consiste en uno cualquiera de los agentes de unión a OX40R de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, fusionado a una región constante de inmunoglobulina.

7. Un agente de unión a OX40R que es una sal de un agente de unión a OX40R de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un agente de unión a OX40R que es un conjugado o un complejo activo de un agente de unión a OX40R de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con una molécula escogida entre marcadores radiactivos, biotina, marcadores fluorescentes, agentes citotóxicos y agentes de entrega de fármacos.

9. Un ácido nucleico que codifica un agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6.

10. Un vector de expresión de origen vírico o plasmídico que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

11. A célula hospedadora procariota o eucariota, que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una línea celular estable aislada, sustancialmente enriquecida en células de acuerdo con la reivindicación

11.

13. La línea celular de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el agente de unión a OX40R es secretado o expresado sobre la superficie de la membrana.

14. Un método para producir un agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el cultivo de células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13 y la recogida de dicho agente de unión.

15. Preparaciones purificadas de los agentes de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8.

16. Uso de los agentes de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, como un medicamento.

17. Una composición farmacéutica para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con los linfocitos T CD4+, que comprende un agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, como ingrediente activo.

18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, en combinación con soportes, excipientes, estabilizadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

19. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en donde las enfermedades relacionadas con los linfocitos T CD4+ son rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunes, inflamaciones o infecciones.

20. Uso de los agentes de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, o de las células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, para la detección del dominio extracelular de la proteína OX40R como una proteína unida a la membrana o soluble.

21. Uso de los agentes de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, o de las células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, para la detección de linfocitos T CD4+ activados.

22. Soportes para la detección, la purificación y/o la concentración del dominio extracelular de OX40R, como

una proteína unida a la membrana o soluble, o de linfocitos T CD4+ activados, teniendo dichos soportes un agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en forma inmovilizada.

23. Métodos para la detección, la purificación y/o la concentración del dominio extracelular de OX40R, como una proteína unida a la membrana o soluble, o de linfocitos T CD4+ activados en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con los soportes de acuerdo con la reivindicación 22, o con las células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el método se utiliza para diagnosticar un estado asociado con una presencia incrementada o disminuida de linfocitos T CD4+ o de proteína OX40R soluble.

25. Uso del agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, o de las células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamaciones o infecciones.

26. Un ensayo de escrutinio para determinar la naturaleza y la actividad de compuestos que modulan las interacciones entre OX40R-OX40L que comprende:

a) la formación de una muestra que comprende los siguientes elementos:

i. un elemento que constituye el agente de unión a OX40R, elegido entre los compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, las células de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13 y los soportes de acuerdo con la reivindicación 22;

ii. un elemento que constituye el resto de OX40R, escogido entre una proteína que comprende el dominio extracelular de OX40R, una línea celular que expresa el domino extracelular de OX40R en su superficie y una línea celular que secreta el dominio extracelular de OX40R; y

iii. el (los) compuesto (s) que se van a someter a ensayo como modulador (es) de las interacciones entre OX40R-OX40L;

b) la detección, directa o indirecta, del efecto de los compuestos (iii) sobre las interacciones entre los elementos (i) e (ii) ;

c) la comparación del efecto detectado en (b) entre las diferentes muestras en términos de calidad y/o de cantidad de los elementos de (a) .

27. Un equipo de reactivos para la detección del dominio extracelular de la proteína OX40R o de linfocitos T CD4+ activados, que comprende un agente de unión a OX40R de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, una célula de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13 o un soporte de acuerdo con la reivindicación 22.

28. Un equipo de reactivos de acuerdo con la reivindicación 27, para el diagnóstico de un estado debido a una presencia incrementada o disminuida de linfocitos T CD4+ o de la proteína soluble OX40R en una muestra obtenida a partir de un paciente.