Mutantes de FSH.

Un ácido nucleico que codifica una subunidad α mutante de FSH,

donde la subunidad α comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4-5.

Mutantes de FSH

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de ¡a invención

La presente invención se refiere a la reproducción humana. Más específicamente, la presente invención se refiere a terapias de fertilización.

2. Descripción de ia Técnica Reiacionada

a. Gonadotropinas

La hormona estimulante del folículo (FSH) es un miembro de la familia de las gonadotropinas que desempeñan funciones clave en la fertilidad humana. Las gonadotropinas, que también incluyen la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG), son heterodímeros, que constan todas de una subunidad a común (92 aminoácidos) y una subunidad [3 única (111 aminoácidos en la FSH). Las secuencias de aminoácido de las formas maduras de las subunidades a y [3 de FSH se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

La FSH humana ha sido aislada a partir de las glándulas pituitarias y a partir de orina postmenopausal (EP 322.438) y se ha producido recombinantemente en células de mamífero (Patentes de EE UU. n° 5.639.640, 5.156.957, 4.923.805, 4.840.896, 5.767.251, y documentos EP 211.894 y EP 521.586). Las últimas referencias también describen el gen de subunidad [3 de FSH humano. La Patente de EE UU. n° 5.405.945 describe un gen de subunidad a humano modificado que comprende solo un intrón.

Liu et al., J. Biol. Chem. 1993, 15; 268 (2): 21613-7, Grossmann et al., Mol. Endocrinol 1996 10 (6): 769-79, Roth y Dias (Mol. Cell Endocrinol. 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yooetal., J. Biol. Chem. 1993 25; 268 (18): 13034-42), Patente de EE UU. n° 5.508.261 y Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 describen varios estudios de relación estructura-función e identifican residuos de aminoácido implicados en la unión y activación de receptor y en la dimerización de FSH.

b. Uso de gonadotropinas en técnicas de reproducción asistida

Las gonadotropinas desempeñan una función crucial en el ciclo reproductivo, y su uso en terapias exógenas es esencial para las técnicas de reproducción asistida (ART), tales como la fertilización /n v/fro (IVF), IVG en combinación con inyección intracitoplasmática de esperma (IVF/ICSI) y transferencia de embrión (ET), así como para la inducción de la ovulación (OI) en pacientes que se someten a fertilización /n v/vo, tanto natural como mediante inseminación intrauterina (IUI).

Las patentes de EE UU. n° 4.589.402 y 4.845.077 describen FSH humana que está libre de LH y el uso de la misma para fertilización /n v/fro. El documento EP 322 438 describe una proteína que tiene al menos 6200 U/mg de actividad de FSH, que está sustancialmente libre de actividad de LH, y donde la subunidad a y la subunidad [3 de FSH, respectivamente, pueden ser naturales o formas truncadas especificadas de las mismas.

Las terapias prolongadas son necesarias para lograr un efecto terapéutico, típicamente durante 8-10 días consecutivos y a veces hasta 21 días, para estimular la foliculogénesis en mujeres, y durante hasta 18 meses en hombres hipogonadotróficos para inducir la espermatogénesis. La hFSH recombinante se administra típicamente como una inyección i.m. ó s.c. diaria, con las consiguientes molestias y las potenciales reacciones locales en la zona de inyección. Una disminución de la frecuencia de administración facilitaría la terapia y haría que la administración de la gonadotropina fuera más cómoda, más tolerable y aceptada por el paciente.

c. Glicosilación de FSH

Las gonadotropinas son glicoproteínas, cuyas subunidades tienen cadenas laterales de oligosacáridos ligadas a asparagina (N-ligadas) que son importantes para la actividad y la función /n v/vo. La adición de carbohidratos (glicosilación) a polipéptidos es un proceso post-traduccional que da como resultado la adición de cadenas de azúcares a aminoácidos específicos de asparagina (N-ligados) o serina/treonina (O-ligados). Al contrario que la secuencia de aminoácidos invariante de la porción proteica de las glicoproteínas, las estructuras de carbohidratos son variables, una característica definida como microheterogeneidad. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación de la misma proteína pueden contener estructuras de carbohidratos diferentes. Además, incluso en el mismo sitio de glicosilación de una glicoproteína dada, se pueden observar diferentes estructuras de carbohidratos. Esta heterogeneidad es consecuencia de la síntesis de carbohidratos no dirigida por plantilla.

La N-glicosilación de proteínas se produce específicamente en la estructura de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, y en menor medida en la estructura de consenso Asn-Xaa-Cys, donde Xaa puede ser cualquier residuo de aminoácido. Sin embargo, la presencia de un tripéptido de consenso no es suficiente para asegurar que un residuo de

asparagina sea glicosilado. Por ejemplo, la N-glicosilación de la secuencia Asn-Pro-Ser/Thr se produce a una velocidad 50 veces menor que la de otras estructuras de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr.

La FSH humana contiene cuatro sitios de glicosilación N-ligados: dos en la subunidad a común en las posiciones 52 y 78, y dos en la subunidad [3 en las posiciones 7 y 24. Los carbohidratos unidos a la subunidad a de FSH son críticos para el ensamblaje, la integridad, la secreción y la transducción de señal de dímeros, mientras que los carbohidratos de subunidad [3 son importantes para el ensamblaje, secreción y eliminación de dímeros del heterodímero procedente de la circulación.

Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100, demuestran que las variantes de FSH producidas en un línea celular CHO de N-acetilglucosamina transferasa-l o una línea celular CHO deficiente en transporte de ácido siálico son tan activas como la FSH secretada por células naturales o por FSH pituitaria purificada /n v/fro, pero carecen de actividad /n v/vo, presumiblemente debido a una rápida eliminación de las variantes glicosiladas inadecuadamente a través del suero. D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7, describen vahas ¡soformas de FSH que circulan en el torrente sanguíneo. Las ¡soformas tienen secuencias de aminoácido idénticas, pero difieren en la extensión de la modificación post-traduccional. Se observó que el grupo de ¡soformas menos ácidas presentaba una eliminación /n v/vo más rápida en comparación con el grupo de ¡soformas ácidas, posiblemente debido a diferencias en el contenido de ácido siálico entre las ¡soformas. Además, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40, concluyen que la vida media en circulación parecer ser el determinante fundamental de la actividad /n v/vo. Estas observaciones conducen a la hipótesis de que la vida media de la FSH podría aumentarse introduciendo sitios de glicosilación adicionales para aumentar el contenido de ácido siálico del polipéptido.

d. Variantes de FSH

Se han desarrollado agonistas de FSH con vidas medias incrementadas fusionando el péptido carboxiterminal de hCG (CTP) con FSH humana recombinante nativa (rhFSH). El resto CTP consta de los aminoácidos 112-118 a 145 con cuatro sitios de glicosilación O-ligados localizados en las posiciones 121, 127, 132 y 138. Las Patentes de EE UU. 5.338.835 y 5.585.345 describen una subunidad [3 de FSH modificada extendida en la Glu C-terminal con el resto CTP de hCG. Se establece que el análogo modificado resultante tiene la actividad biológica de la FSH nativa, pero una vida media en circulación prolongada. La Patente de EE UU. n° 5.405.945 describe que la porción carboxiterminal de la subunidad [3 de hCG o de una variante de la misma presenta efectos significativos sobre la eliminación de CG, FSH y LH.

La Patente de EE.UU. n° 5.883.073 describe proteínas de cadena sencilla que constan de dos subunidades a con actividad de agonista o antagonista para CG, TSH, LH y FSH. La Patente de EE.UU. n° 5.508.261 describe polipéptidos heterodiméricos que tienen afinidad de unión por receptores LH y FSH que comprenden una subunidad a de hormona de glicoproteína y un polipéptido de subunidad [3 que no es natural, donde el polipéptido de subunidad [3 es una cadena de aminoácidos que comprende cuatro subsecuencias unidas, cada una de las cuales se selecciona de una lista de secuencias específicas. Klein et al. (2003) describe un único análogo de cadena sencilla de FSH con una vida media incrementada, donde las subunidades a y [3 están ligadas a un oligopéptido que contiene dos sitios de glicosilación N-ligados.

El documento WO 01/58493 describe 77 mutaciones que pueden realizarse en la subunidad a de la FSH y 51 mutaciones que pueden realizarse en la subunidad [3 de la FSH en un intento de mejorar la vida media /n v/vo de la FSH. Adicionalmente,... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que codifica una subunidad a muíante de FSH, donde la subunidad a comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4-5.

2. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El vector de la reivindicación 2, donde el vector es un vector de expresión.

4. El vector de la reivindicación 2, donde el vector comprende además un ácido nucleico que codifica la secuencia de SEQ ID NO: 3.

5. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 2.

6. La célula hospedante de la reivindicación 5, donde la célula es una célula de mamífero.

7. Una FSH muíante, donde la subunidad [3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 y donde la subunidad a comprende una secuencia codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

8. La FSH muíante de la reivindicación 7, donde uno cualquiera de los residuos de asparagina 0 a 6 están glicosilados.

9. La FSH muíante de la reivindicación 7, donde la subunidad a comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4 y donde N5 está glicosilado.

10. La FSH muíante de la reivindicación 7, donde la subunidad a comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y donde N5 está glicosilado.

11. Un método para producir un muíante de FSH que comprende:

(a) proporcionar una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un segundo ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 3;

(b) cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión del primer y del segundo ácidos nucleicos.

12. El método de la reivindicación 11, donde la célula es capaz de gllcosllaruna proteína.

13. El método de la reivindicación 11, donde la célula comprende un único vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 3.

14. El método de la reivindicación 11, donde la célula comprende un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, y que comprende además un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 3.

15. Una composición farmacéutica que comprende la FSH muíante de la reivindicación 7, y opclonalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 para uso en el tratamiento de un mamífero no fértil.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 para uso en la estimulación de la foliculogénesis en un mamífero.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 para uso en la inducción de la hiperestimulación de ovarios en un mamífero.