Métodos para producir anticuerpos scFv activos y bibliotecas para los mismos.

Biblioteca de anticuerpos que comprende al menos aproximadamente 108;

clones de anticuerpos scFv unicos, en la que cada clon de anticuerpo scFv unico codifica para un anticuerpo scFv unico que comprende al menos una de una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica, y en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para una secuencia de entramado identica a una secuencia de entramado codificada por un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 32.

Metodos para producir anticuerpos scFv activos y bibliotecas para los mismos Campo Esta descripcion se refiere a anticuerpos de cadena sencilla recombinantes y a metodos de produccion y uso de 5 tales anticuerpos.

Antecedentes Los enfoques de ingenieria genetica han permitido la produccion de anticuerpos recombinantes que tienen especificidades de union especificas, estructuras de dominios especificas y otras propiedades deseables. Un tipo de anticuerpo modificado por ingenieria genetica es el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Los fragmentos Fv de 10 cadena sencilla son polipeptidos modificados por ingenieria genetica que contienen una region variable de cadena pesada (VH) unida a una region variable de cadena ligera (VL) mediante un ligador peptidico flexible. Cada dominio VH y VL contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) . Las CDR son secuencias de aminoacidos cortas que varian enormemente entre moleculas de anticuerpo y, por tanto, son responsables de la generacion de la gran diversidad de especificidad de union de anticuerpos. La combinacion de las CDR de la VH

mas las CDR de la VL determina la especificidad de union de cualquier anticuerpo dado.

Los fragmentos Fv de cadena sencilla presentan la especificidad de union y afinidad de union monovalente de anticuerpos de tamano completo y proporcionan el beneficio anadido de facilidad relativa de manipulacion y expresion geneticas (porque los scFv se codifican por y se expresan a partir de una unica secuencia codificante, en vez de secuencias codificantes separadas, como los anticuerpos de tamano completo) . Los fragmentos Fv de cadena sencilla y otros anticuerpos recombinantes se usan en una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, en pruebas de diagnostico medico, en investigacion basica; y como tratamientos de anticuerpos terapeuticos para diversas enfermedades.

Los intracuerpos son moleculas de anticuerpos modificados por ingenieria genetica que se expresan de manera ectopica dentro de las celulas. Pueden usarse intracuerpos para visualizar o modular la funcion de un antigeno diana 25 dentro de celulas vivas. Por ejemplo, el uso de intracuerpos puede inducir una desactivacion fenotipica o bien mediante la inhibicion directa de la funcion del antigeno seleccionado como diana o bien mediante el desvio del antigeno seleccionado como diana de su ubicacion intracelular normal (por ejemplo, un intracuerpo puede redirigir su antigeno diana a la maquinaria de degradacion) . Los intracuerpos tambien pueden potenciar o cambiar la funcion de sus antigenos diana. Para dianas proteicas, los intracuerpos pueden dirigirse a una modificacion postraduccional especifica o a una conformacion de antigeno especifica. Ademas, una desactivacion fenotipica inducida por intracuerpos puede estar confinada a un compartimento celular especifico mediante el direccionamiento de un intracuerpo al compartimento subcelular especifico usando una senal de encauzamiento (por ejemplo, una senal de localizacion nuclear, una senal de localizacion mitocondrial o una senal de retencion en el reticulo endoplasmico) . Los intracuerpos tambien pueden modular la funcion de la diana modificando la estructura oligomerica de la diana.

Debido a que la desactivacion fenotipica por intracuerpos se basa solo en la capacidad de union de la molecula de anticuerpo a su diana, no es necesario expresar dentro de la celula una molecula de anticuerpo completa sino solo su sitio de union, que esta completamente ubicado dentro de la region variable (Fv) . Dadas sus ventajas de tamano pequeno y especificidad de antigeno abarcada dentro de una unica cadena polipeptidica, los scFv son el tipo mas comun de fragmento de anticuerpo recombinante usado para la expresion de anticuerpos intracelulares.

Una grave limitacion en el uso de intracuerpos es que la mayoria de los scFv no pueden plegarse en las condiciones reductoras del nucleo y el citosol celular. En tales condiciones, los dos puentes disulfuro conservados de scFv se reducen, desestabilizandose e inactivandose de ese modo la actividad de union de muchos scFv. In vitro, la mayoria de los scFv no pueden renaturalizarse en condiciones reductoras. Analisis estadisticos de secuencias de scFv han mostrado que menos del 1% de los scFv son lo suficientemente estables como para expresarse y ser activos en 45 ausencia de formacion de enlaces disulfuro. Ademas, incluso si una proteina scFv es de hecho lo suficientemente estable en su forma reducida como para expresarse y ser activa in vivo, otros parametros tales como susceptibilidad a proteasas o cinetica de plegamiento pueden influir tambien en el destino in vivo final del intracuerpo y por tanto son criticos para la actividad y expresion de intracuerpos final.

Para obtener un intracuerpo activo, los enfoques actuales implican a menudo dos etapas sucesivas. En primer lugar, 50 se identifica un panel de anticuerpos scFv o Fab que se unen especificamente a un antigeno de interes (por ejemplo, examinando una biblioteca de presentacion en fago) . En segundo lugar, los anticuerpos que se unen especificamente se someten a prueba para determinar su capacidad para unirse y/o inhibir el antigeno diana in vivo. Debido a que menos del 1% de los scFv son potencialmente utiles como intracuerpos (debido a que no se expresan y/o no pueden plegarse apropiadamente en las condiciones reductoras que existen dentro de una celula) , la identificacion de scFv individual que puede usarse como intracuerpo requiere el aislamiento de mas de 100 clones de scFv, un numero que es improbable que se obtenga en la mayoria de los casos.

La solicitud WO 00/5405º da a conocer un metodo para determinar la capacidad de una inmunoglobulina para unirse a una antigeno diana en un entorno intracelular. El metodo dado a conocer consiste en proporcionar i) una inmunoglobulina intracelular asociada con una primera molecula, y ii) un antigeno diana intracelular asociado con una segunda molecula, luego evaluar la interaccion intracelular entre la inmunoglobulina frente a la diana en el entorno intracelular, sabiendo que cuando las moleculas primera y segunda se llevan a interaccion estable mediante la union de la inmunoglobulina a la diana en el entorno intracelular, se genera una senal. Para evaluar la posibilidad de realizar este metodo en celulas de mamifero, se ha llevado a cabo una prueba con una primera proteina de fusion que comprende betaºgalactosidasa, y una segunda proteina de fusion que comprende el scFvR4 antiº beta galactosidasa.

La solicitud WO 01/4 º01 da a conocer un metodo para aislar un scFv con un entramado que es estable y soluble en un entorno reductor. El metodo dado a conocer se realiza usando un "ensayo de dos hibridos" que comprende las siguientes etapas:

a) se genera una biblioteca de scFv con CDR constantes y entramados variados mediante la mutacion de al menos una region codificante de entramado de la secuencia de ADN de un scFv frente a un antigeno conocido y mediante la introduccion de tales mutaciones en vectores de expresion adecuados, b) se transforman celulas huesped que pueden expresar un antigeno conocido especifico y que solo sobreviven en presencia de interaccion antigenoºscFv con dicha biblioteca de scFv, c) se cultivan las celulas huesped asi transformadas en condiciones adecuadas para expresar el antigeno y el scFv y que permiten la supervivencia celular solo en presencia de interaccion antigenoº scFv, d) se aisla el scFv expresado en las celulas supervivientes y que tiene un entramado definido que es estable y soluble en el entorno reductor.

Der Maur Adrian et al. (Methods, 34: 215º224, 2004) y Der Maur Adrian et al. (Journal of Biological Chemistr y , 2ºº (4º) : 450º 5º450 º5, 2002) dan a conocer metodos para aislar un scFv con un entramado que es estable y soluble en un entorno reductor.

Der Maur Adrian et al. (Methods, 34: 215º224, 2004) ensena en la tabla 1 que de un total de 10 clones examinados, solo un 0, 1% permiten el crecimiento celular en condiciones selectivas, y solo un º0% de estos clones que permiten el crecimiento celular en condiciones selectivas muestran expresion de lacZ dependiente de scFv.

Laden et al. (Research in Microbiology, 153: 4º ºº4º 4, 2002) dieron a conocer un mutante de un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla antiº betaº galactosidasa humano, denominado scFv13R4, y muestran que scFv13R4 puede plegarse apropiadamente en el citoplasma de Escherichia coli y es activo in vivo en levaduras puesto que puede interaccionar con betaº galactosidasa en un ensayo de dos hibridos.

Jung y pluckthun (protein Engineering, 10 (º) : º5 , 1º ºº) da a conocer un metodo para mejorar... [Seguir leyendo]

1. Biblioteca de anticuerpos que comprende al menos aproximadamente 10 clones de anticuerpos scFv unicos, en la que cada clon de anticuerpo scFv unico codifica para un anticuerpo scFv unico que comprende al menos una de una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica, y en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para una secuencia de entramado identica a una secuencia de entramado codificada por un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 32.

2. Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VH CDR3 unica.

3. Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VL CDR3 unica.

4. Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica.

5. Metodo para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula, que comprende:

a) proporcionar una primera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la primera coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VH, en el que la primera coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VL identica a la secuencia VL de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID IVO: 33;

b) proporcionar una segunda coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la segunda coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VL, en el que la segunda coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VH identica a la secuencia VH de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 33;

c) unir dominios VH de clones de anticuerpos scFv de la primera coleccion con dominios VL de clones de anticuerpos scFv de la segunda coleccion para obtener una tercera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la tercera coleccion contiene clones de anticuerpos scFv que comprenden una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VH y una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VL, preparando de ese modo la biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula.

º. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la primera coleccion comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VH y en el que la segunda coleccion comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VL.

º. Biblioteca de anticuerpos producida mediante el metodo segun la reivindicacion 5.

º. Metodo para construir una biblioteca de anticuerpos que comprende:

a) seleccionar el entramado de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 33 como entramado de anticuerpo scFv;

b) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VH del entramado de anticuerpo scFv para generar una primera biblioteca que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VH unica;

c) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VL del entramado de anticuerpo scFv para generar una segunda biblioteca que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VL unica;

d) eliminar, de la primera biblioteca, clones que no expresan de manera detectable anticuerpo scFv;

e) eliminar, de la segunda biblioteca, clones que no expresan de manera detectable anticuerpo scFv; y f) recombinar las bibliotecas primera y segunda para generar una biblioteca final que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VH unica y una region CDR3 VL unica;

construyendo de ese modo la biblioteca de anticuerpos.