MÉTODO PARA LA DETECCIÓN EFICIENTE DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE DOBLE CADENA.

Un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden,

como elementos: -un grupo de cebadores para la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP), que comprende: un primer cebador directo que contiene una secuencia F2, que es complementaria a una secuencia arbitraria de F2c, y, en el extremo 5' de F2, una secuencia arbitraria F1c, un segundo cebador directo que contiene una secuencia F3 que es complementaria a una secuencia arbitraria F3c, un primer cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R2 y, en el extremo 5' de R2, una secuencia R1c, que es complementaria a una secuencia arbitraria R1, y un segundo cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R3, en la que la primera secuencia arbitraria de F1c, la segunda secuencia arbitraria de F2c, y la tercera secuencia arbitraria de F3c son seleccionables, en este orden, desde el extremo 3' en una región diana hacia el extremo 3' de la cadena de polinucleótidos que constituye un ácido nucleico a detectar y la cuarta secuencia arbitraria de R1, la quinta secuencia arbitraria de R2, y la sexta secuencia arbitraria de R3 son seleccionables, en este orden, desde el extremo 5' en la región diana hacia el extremo 5' de dicha cadena de polinucleótidos, -una síntesis de tipo de desplazamiento de cadenas catalizada por polimerasa de cadenas complementarias, -un nucleótido que sirve como sustrato para la síntesis de cadenas complementarias, -un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1, y -un compuesto que reacciona más preferiblemente con un intercalante unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que con un intercalante unido a un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicho compuesto es un oxidante seleccionado del grupo que consiste en: hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno, y permanganato de potasio

Método para la detección eficiente de ácidos nucleicos de doble cadena.

Área técnica La presente invención está relacionada con un equipo para detectar ácidos nucleicos que pueden detectar ácidos nucleicos de doble cadena usando un agente intercalante con una sensibilidad superior.

Antecedentes

El método más general para detectar el producto de amplificación obtenido de la amplificación de ácidos nucleicos, como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) , se lleva a cabo tras la amplificación sometiendo la solución a una electroforesis en gel de agarosa y uniendo un agente intercalante fluorescente como el bromuro de etidio, y observando luego la fluorescencia específica. Cuando no hay posibilidad de contaminación por otro DNA y sólo interesa la aparición del producto de la amplificación, la fluorescencia puede observarse añadiendo un agente intercalante fluorescente a la solución después de la amplificación y omitiendo la electroforesis. Un agente intercalante fluorescente, sin embargo, se une al DNA de cadena sencilla como un cebador y emite fluorescencia. Por consiguiente, la señal fluorescente detectada puede contener un nivel significativo de ruido de fondo.

Recientemente, los presentes inventores han conseguido desarrollar un nuevo método para la amplificación de ácidos nucleicos, que no requiere el complicado control de temperatura que se supone inevitable en la PCR, es decir, el método de amplificación isotérmica mediada por lazo, (LAMP, “loop-mediated isothermal amplification”) (Notomi, T. et al., Nucleic Acids Res. 28 (12) , e63 (2000) , WO 00/28082) . En el método LAMP, la región 3' terminal del molde de polinucleótidos autohibrida, la síntesis de hebras complementarias se inicia a partir de ese punto, y se utiliza en combinación un cebador que hibrida con el bucle formado en la síntesis mencionada anteriormente. Esto permite la amplificación bajo condiciones isotérmicas, y mejora extraordinariamente la simplicidad de la amplificación del ácido nucleico.

En la monitorización a tiempo real del producto de amplificación de ácidos nucleicos utilizando un agente intercalante fluorescente, la intensidad de la fluorescencia varía significativamente en la PCR ya que el producto de amplificación de ácidos nucleicos se disocia y reasocia repetidamente debido a la desnaturalización térmica a medida que se realiza un ciclo térmico. En el método LAMP, sin embargo, la intensidad de la fluorescencia no varía ya que la reacción se realiza bajo condiciones isotérmicas. Por lo tanto, el método LAMP es más apropiado para la monitorización a tiempo real del producto de la amplificación de ácidos nucleicos. El método LAMP, sin embargo, requiere aproximadamente 10 veces la cantidad necesaria de cebadores en la PCR. Cuando se pretende detectar el producto de la amplificación de ácidos nucleicos obtenido por el método LAMP usando un agente intercalante fluorescente, el nivel de ruido de fondo causado por los cebadores de cadena sencilla, que también están presentes, es elevado. Por lo tanto, es difícil detectar con elevada sensibilidad solamente los ácidos nucleicos de doble cadena amplificados.

Un objeto de la presente invención es proporcionar los medios para detectar ácidos nucleicos que puedan detectar ácidos nucleicos de doble cadena usando un agente intercalante con una sensibilidad superior reduciendo las señales derivadas de la unión del agente intercalante a los ácidos nucleicos de cadena sencilla.

Los presentes inventores han realizado estudios intensivos para alcanzar el anterior objeto. Como resultado, han logrado reducir las señales derivadas de la unión del agente intercalante a los ácidos nucleicos de cadena sencilla con la adición de un compuesto a una mezcla compuesta por ácidos nucleicos de cadena doble y de cadena sencilla ambos con agentes intercalantes unidos, compuesto que reacciona preferiblemente con un agente intercalante unido a los ácidos nucleicos de cadena sencilla respecto a un agente intercalante unido a ácidos nucleicos de cadena doble, o un compuesto que se une a ácidos nucleicos de cadena sencilla de forma más fuerte que un agente intercalante y se une a los ácidos nucleicos de doble cadena de forma más débil que un agente intercalante. Esto conduce a la finalización de la presente invención.

La presente invención proporciona un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos:

un grupo de cebadores para la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) , que comprende:

un primer cebador directo que contiene una secuencia F2, que es complementaria a una secuencia arbitraria de F2c, y, en el extremo 5' de F2, una secuencia arbitraria F1c, un segundo cebador directo que contiene una secuencia F3 que es complementaria a una secuencia arbitraria F3c, un primer cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R2 y, en el extremo 5' de R2, una secuencia R1c, que es complementaria a una secuencia arbitraria R1, y un segundo cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R3, en la que la primera secuencia arbitraria de F1c, la segunda secuencia arbitraria de F2c, y la tercera secuencia arbitraria de F3c son seleccionables, en este orden, desde el extremo 3' en una región diana hacia el extremo 3' de la cadena de polinucleótidos que constituye un ácido nucleico a detectar y la cuarta secuencia arbitraria de R1, la quinta secuencia arbitraria de R2, y la sexta secuencia arbitraria de R3 son seleccionables, en este orden, desde el extremo 5' en la región diana hacia el extremo 5' de dicha cadena de polinucleótidos; una síntesis de tipo de desplazamiento de cadenas catalizada por polimerasa de cadenas complementarias un nucleótido que sirve como sustrato para la síntesis de cadenas complementarias; un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1; y un compuesto que reacciona más preferiblemente con un intercalante unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que con un intercalante unido a un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicho compuesto es un oxidante seleccionado del grupo que consiste en: hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno, y permanganato de potasio.

La presente invención proporciona además un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos: un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1; y un compuesto que reacciona más preferiblemente con un intercalante unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que con un intercalante unido a un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicho compuesto es un reductor seleccionado del grupo que consiste en: borhidruro sódico y cianoborhidruro sódico.

La presente invención proporciona además un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos: un grupo de cebadores para la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) , que comprenden: un primer cebador directo que contiene una secuencia de F2, que es complementaria a una secuencia arbitraria de F2c, y, en el extremo 5' de F2, una secuencia arbitraria de F1c, un segundo cebador directo que contiene una secuencia de F3 que es complementaria a una secuencia arbitraria de F3c, un primer cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria de R2 y, en el extremo 5' de R2, una secuencia R1c, que es complementaria a una secuencia arbitraria de R1, y un segundo cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria de R3, en la que la primera secuencia arbitraria de F1c, la segunda secuencia arbitraria de F2c, y la tercera secuencia arbitraria de F3c son seleccionables, en este orden, desde el extremo 3' en una región diana hacia el extremo 3' de la cadena de polinucleótidos que constituye un ácido nucleico a detectar y la cuarta secuencia arbitraria de R1, la quinta secuencia arbitraria de R2, y la sexta secuencia arbitraria de R3 son seleccionables, en este orden, desde el extremo 5' en la región diana hacia el extremo 5' de dicha cadena de polinucleótidos; una síntesis de tipo de desplazamiento de cadena catalizado por polimerasa de cadenas complementarias; un nucleótido que sirve como sustrato para la síntesis de cadenas complementarias; un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1; y un compuesto que está unido a un ácido nucleico de cadena sencilla más fuertemente que un intercalante y que está unido a un ácido nucleico de doble cadena más débilmente que... [Seguir leyendo]

1. Un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos:

- un grupo de cebadores para la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) , que comprende: un primer cebador directo que contiene una secuencia F2, que es complementaria a una secuencia arbitraria de F2c, y, en el extremo 5' de F2, una secuencia arbitraria F1c, un segundo cebador directo que contiene una secuencia F3 que es complementaria a una secuencia arbitraria F3c, un primer cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R2 y, en el extremo 5' de R2, una secuencia R1c, que es complementaria a una secuencia arbitraria R1, y un segundo cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria R3,

en la que la primera secuencia arbitraria de F1c, la segunda secuencia arbitraria de F2c, y la tercera secuencia arbitraria de F3c son seleccionables, en este orden, desde el extremo 3' en una región diana hacia el extremo 3' de la cadena de polinucleótidos que constituye un ácido nucleico a detectar y la cuarta secuencia arbitraria de R1, la quinta secuencia arbitraria de R2, y la sexta secuencia arbitraria de R3 son seleccionables, en este orden, desde el extremo 5' en la región diana hacia el extremo 5' de dicha cadena de polinucleótidos, -una síntesis de tipo de desplazamiento de cadenas catalizada por polimerasa de cadenas complementarias, -un nucleótido que sirve como sustrato para la síntesis de cadenas complementarias, -un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1, y -un compuesto que reacciona más preferiblemente con un intercalante unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que con un intercalante unido a un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicho compuesto es un oxidante seleccionado del grupo que consiste en: hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno, y permanganato de potasio.

2. Un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos:

- un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1, y -un compuesto que reacciona más preferiblemente con un intercalante unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que con un intercalante unido a un ácido nucleico de doble cadena, en el que dicho compuesto es un reductor seleccionado del grupo que consiste en: borhidruro sódico y cianoborhidruro sódico.

3. Un equipo para detectar ácidos nucleicos de doble cadena que comprenden, como elementos:

- un grupo de cebadores para la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) , que comprenden: un primer cebador directo que contiene una secuencia de F2, que es complementaria a una secuencia arbitraria de F2c, y, en el extremo 5' de F2, una secuencia arbitraria de F1c, un segundo cebador directo que contiene una secuencia de F3 que es complementaria a una secuencia arbitraria de F3c, un primer cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria de R2 y, en el extremo 5' de R2, una secuencia R1c, que es complementaria a una secuencia arbitraria de R1, y un segundo cebador reverso que contiene una secuencia arbitraria de R3, en la que la primera secuencia arbitraria de F1c, la segunda secuencia arbitraria de F2c, y la tercera secuencia arbitraria de F3c son seleccionables, en este orden, desde el extremo 3' en una región diana hacia el extremo 3' de la cadena de polinucleótidos que constituye un ácido nucleico a detectar y la cuarta secuencia arbitraria de R1, la quinta secuencia arbitraria de R2, y la sexta secuencia arbitraria de R3 son seleccionables, en este orden, desde el extremo 5' en la región diana hacia el extremo 5' de dicha cadena de polinucleótidos, -una síntesis de tipo de desplazamiento de cadena catalizado por polimerasa de cadenas complementarias, -un nucleótido que sirve como sustrato para la síntesis de cadenas complementarias, -un intercalante, seleccionado de entre el grupo que consiste en: bromuro de etidio, naranja de acridina, TO-PRO-1, y YOPRO-1, y -un compuesto que está unido a un ácido nucleico de cadena sencilla más fuertemente que un intercalante y que está unido a un ácido nucleico de doble cadena más débilmente que un intercalante, en el que dicho compuesto es un segundo intercalante seleccionado del grupo que consiste en: azul de metileno, actinomicina D, SYBR Green 2, y OliGreen.

Fig. 4