ENSAYO CUANTITATIVO PARA LA DETECCION DE ARN RECIENTEMENTE SINTETIZADO EN UN SISTEMA LIBRE DE CELULAS E IDENTIFICACION DE INHIBIDORES DE LA SINTESIS DE ARN.

Un método para determinar si un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva,

que comprende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marca- do;

cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;

comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y

en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/009959.

Solicitante: ACHILLION PHARMACEUTICALS, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 300 GEORGE STREET,NEW HAVEN, CT 06511.

Inventor/es: HUANG,MINGJUN, SUN,YONGNIAN, YANG,WENGANG.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68B2
  • C12Q1/70B6A

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Clasificación antigua:

  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Fragmento de la descripción:

Ensayo cuantitativo para la detección de ARN recientemente sintetizado en un sistema libre de células e identificación de inhibidores de la síntesis de ARN.

Referencia cruzada a solicitud relacionada

Esta Solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud provisional U.S. 60/555.765 presentada el 6 de enero de 2003.

Antecedentes

El HCV es una de las causas más diagnosticadas de enfermedad hepática crónica de los Estados Unidos de América, que da cuenta de alrededor de 15 por ciento de hepatitis vírica aguda, 60 a 70 por ciento de hepatitis crónica, y hasta 50 por ciento de cirrosis, enfermedad hepática de etapa terminal, y cáncer de hígado. Casi 4 millones de norteamericanos, o 1,8 por ciento de la población de los Estados Unidos de América, tiene anticuerpos frente a HCV (es decir, anticuerpos anti-HCV), indicando una infección en curso o previa con el virus. La hepatitis B provoca 8.000 a 10.000 muertes anualmente en los Estados Unidos de América. Mientras que la fase aguda de la infección por HCV se asocia habitualmente con síntomas leves, algunas pruebas sugieren que sólo alrededor de 15% a alrededor de 20% de las personas infectadas evitará HCV.

HCV es un virus de ARN pequeño, con cubierta, monocatenario de cadena positiva en la familia del Flaviviridae. El genoma incluye aproximadamente 10.000 nucleótidos y codifica una única poliproteína de alrededor de 3.000 aminoácidos. Todos los productos proteicos de HCV son producidos mediante escisión proteolítica de la poliproteína, llevada a cabo por una de tres proteasas: la peptidasa señal del hospedante, la metaloproteinasa vírica que se autoescinde (NS2), y la serina proteasa vírica (NS3/4A). La acción combinada de estas enzimas produce las proteínas estructurales (C, E1 y E2) y proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, y NS5B) que se requieren para la replicación y empaquetamiento del ARN genómico vírico. NS5B es la ARN polimerasa dependiente de ARN (RDRP) que es responsable de la conversión del ARN genómico de entrada en una copia de hebra negativa (ARN complementario, o ARNc); el ARNc sirve entonces como mueble para la transcripción mediante NS5B del ARN genómico/mensajero de sentido positivo. La HCV replicasa es el complejo de proteínas que son necesarias para la síntesis exacta y eficaz de ARN de replicón vírico.

Actualmente, la única terapia eficaz frente a HCV es alfa-interferón, que reduce la cantidad de virus en el hígado y en la sangre (por ejemplo, carga viral) en sólo una pequeña proporción de pacientes infectados. Sin embargo, ahora las formas estándar de interferón están siendo sustituidas por interferones pegilados (peginterferones), alfa interferones que se han modificado químicamente por adición de una gran molécula inerte de polietilenglicol. Actualmente, el régimen óptimo que incluye interferón parece ser un uso de 24 ó 48 semanas de una combinación de alfa interferón pegilado y el nucleósido ribavirina, un agente antiviral oral que tiene actividad frente a un amplio intervalo de virus. No obstante, las tasas de respuesta a la terapia de combinación de interferón/ribavirina pueden ser moderadas para ciertos genotipos de HCV, es decir, una tasa de respuesta de alrededor de 50% a alrededor de 60%, aunque típicamente las tasas de respuesta para genotipos seleccionados de HCV (principalmente genotipos 2 y 3) son mayores. Otro inconveniente de la terapia actual es que a menudo hay efectos secundarios adversos significativos asociados con cada uno de estos agentes, que incluyen, por ejemplo, síntomas parecidos a la gripe; efectos supresores de la médula ósea; efectos neuropsiquiátricos tales como irritabilidad acentuada, ansiedad, cambios de personalidad, depresión, e incluso suicidio o psicosis aguda; efectos secundarios similares a la histamina; y anemia.

Tomados juntos, los hechos anteriores indican una necesidad significativa de inhibidores eficaces de pequeñas moléculas de la replicación de HCV que no sufran los inconvenientes mencionados anteriormente. Una clase particularmente útil de inhibidores de HCV, así como de otros virus de ARN de hebra positiva, son los inhibidores de la síntesis de ARN vírico.

Aunque los ensayos exactos y eficaces para identificar inhibidores de la síntesis de ARN del HCV pueden ser herramientas útiles para identificar tratamientos eficaces de HCV de pequeñas moléculas, no se ha desarrollado tal sistema. Se ha dado a conocer un ensayo de replicación in vitro que usa NS5B polimerasa recombinante. Sin embargo, en este sistema, la forma purificada de NS5B polimerasa careció de especificidad por el molde y produjo diversas longitudes de productos de ARN. Estos fenómenos son muy diferentes de la replicación de ARN de HCV in vivo. Para reflejar mejor el proceso de replicación del ARN de HCV en la célula, se creó un sistema de replicación del HCV libre de células usando lisados de células completas o fracciones membránicas de células que expresan el replicón del HCV. En este sistema libre de células, se usó P32-UTP o P32-CTP radioactivo para marcar el ARN del HCV recientemente sintetizado, y después los productos de la reacción se resolvieron mediante electroforesis en gel, seguido de autorradiografía. Debido a que estos ensayos requieren electroforesis en gel para separar el ARN de HCV de longitud completa de las otras moléculas de ARN, los resultados son difíciles de cuantificar, a menudo inexactos, y malamente reproducibles. Adicionalmente, aunque parece que está claro que el alargamiento del ARN se produce en este sistema libre de células, no hay pruebas convincentes de que en este sistema se produce el inicio del ARN de novo.

Sumario

Se proporciona aquí un método para determinar si un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva. El método comprende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;

comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y

en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.

Se proporciona adicionalmente aquí un método para cuantificar ARN recientemente iniciado de un virus de ARN de hebra positiva, que comprende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, y un análogo nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la transcripción de la población de ARN recientemente sintetizado;

digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y

cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;

y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.

También se proporciona un método para determinar si un compuesto de ensayo es un inhibidor de la iniciación de la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que comprende:

poner...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para determinar si un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que comprende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marca- do;

cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;

comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y

en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.

2. Un método para cuantificar ARN recientemente iniciado de un virus de ARN de hebra positiva, que com- prende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, y un análogo nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la transcripción de la población de ARN recientemente sinteti- zado;

digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y

cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.

3. Un método para determinar si un compuesto de ensayo es un inhibidor de la iniciación de la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que comprende:

poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro del ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;

hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la población de ARN recientemente sintetizado;

digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;

detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;

cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo; y

comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado pero producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad de ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe el inicio de la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.

4. El método de la reivindicación 1 ó 3, que comprende además proporcionar el complejo de replicasa aislado y el ARN molde del replicón vírico aislado:

transfectando una estirpe celular con un ARN del replicón vírico o un molde de ADN para un replicón vírico para proporcionar una estirpe celular transfectada,

incubando la estirpe celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y

aislando los complejos de replicasa y el ARN molde del replicón vírico a partir de la fracción de membrana celular de las células transfectadas.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el virus de ARN de hebra positiva es el virus de la hepatitis C y el molde de ADN para el replicón vírico es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO:3, SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5.

6. El método de la reivindicación 2, que comprende además proporcionar el complejo de replicasa aislado y el ARN molde del replicón vírico aislado:

transfectando una estirpe celular de hepatoma humano con un ARN de replicón vírico o un molde de ADN para un replicón vírico para proporcionar una estirpe celular transfectada,

incubando la estirpe celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y

aislando los complejos de replicasa que comprenden el ARN molde del replicón vírico procedente de la fracción de membrana celular de las células transfectadas.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el molde de ADN para el replicón vírico es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además proporcionar el complejo de replicasa aislado que comprende el ARN molde del replicón vírico

incubando una célula primaria o estirpe celular infectada con un virus de ARN de hebra positiva en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y

aislando los complejos de replicasa que comprenden el ARN molde del replicón vírico a partir de la fracción de membrana celular de las células infectadas.

9. El método de la reivindicación 1 ó 3, en el que el virus de ARN de hebra positiva es el virus de la hepatitis C.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el análogo nucleotídico marcado es un análogo capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico, un análogo que se puede reconocer vía una reacción de unión de especificidad elevada, o un análogo detectable directamente como resultado de una propiedad física del análogo.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el análogo nucleotídico marcado es un análogo capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el análogo nucleotídico marcado es Br-UTP.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la detección comprende poner en contacto el ARN recientemente sintetizado con un anticuerpo específico para el análogo nucleotídico marcado, e inmunoprecipitar el ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado para formar ARN inmunoprecipitado.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el análogo nucleotídico marcado es Br-UTP, y el anticuerpo específico es un anticuerpo anti-BrdU.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la cuantificación del ARN recientemente sintetizado comprende llevar a cabo una PCR en tiempo real sobre el ARN inmunoprecipitado.

16. El método de la reivindicación 10, en el que el análogo directamente detectable como resultado de una propiedad física del análogo es un nucleótido radioactivo.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la detección comprende electroforesis en gel.

18. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo es un inhibidor del alargamiento del ARN, un inhibidor de la iniciación de la síntesis del ARN o un inhibidor de la actividad del complejo de replicasa.


 

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