METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCION Y EL ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS POR AMPLIFICACION DE SEÑAL.

Un sistema de detección de ácido nucleico que comprende:

una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo;

y

un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra;

en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2006/000322.

Solicitante: NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: BUILDING M58, 1200 MONTREAL ROAD,OTTAWA, ONTARIO K1A 0R6.

Inventor/es: LECLERC,MARIO, HO,HOANG-ANH.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 24 de Febrero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68B2
  • C12Q1/68B2D

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCION Y EL ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS POR AMPLIFICACION DE SEÑAL.

Fragmento de la descripción:

Métodos y composiciones para la detección y el análisis de ácidos nucleicos por amplificación de señal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos, artículos y composiciones para la detección y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra. Más específicamente, la invención se refiere a un sistema integrado novedoso de detección de polinucleótido por amplificación de señal exento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que combina un receptor específico, un transductor óptico y un mecanismo de amplificación. El sistema de la presente invención es altamente sensible, permitiendo la detección específica de oligonucleótidos y polinucleótidos presentes en pequeñas cantidades (concretamente, del orden de aproximadamente 20 copias).

Antecedentes de la invención

Son necesarios biosensores de ADN sencillos y ultrasensibles específicos de secuencia para el diagnóstico rápido de infecciones y enfermedades genéticas, así como para aplicaciones ambientales y forénsicas1. Con este fin, se han propuesto diversos sensores de ADN ópticos y electroquímicos2-8. Sin embargo, la mayoría de estos sensores de ADN propuestos se basan en alguna forma de amplificación química tal como PCR9, que a su vez puede requerir el uso de mezclas complejas y aparatos sofisticados para efectuar las reacciones enzimáticas necesarias.

Más recientemente, se han descrito métodos rápidos de detección de ADN basados en fluorescencia basados en polímeros catiónicos conjugados hidrosolubles10-14, 23-26. En este caso, se usa un polímero policatiónico como multicromóforo que recoge la luz (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nº US 2004/0219556 A1 (4 de noviembre de 2004) (Bazan et al.)). Se proporciona un sensor basado en un ácido nucleico peptídico neutro (PNA) y que tiene un cromóforo de señalización que tiene una secuencia de bases complementaria de un polinucleótido diana de interés. Tras la puesta en contacto del polinucleótido diana en una muestra, se lleva el multicromóforo policatiónico a la proximidad del cromóforo de señalización mediante interacciones electrostáticas con el polinucleótido diana. La excitación del multicromóforo produce entonces la emisión de luz del cromóforo de señalización. Aunque este método proporciona un modo rápido y fiable para medir la cantidad de polinucleótidos en una muestra, no permite por sí mismo la detección de cantidades muy pequeñas de nucleótidos en la muestra.

Por tanto, sigue habiendo necesidad de un método que permita una detección rápida y altamente sensible de polinucleótidos en una muestra sin recurrir a técnicas de amplificación de nucleótidos tales como PCR. Además, sigue habiendo la necesidad de composiciones y artículos de fabricación útiles en dicho método.

La presente invención busca satisfacer estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método que proporciona una detección rápida y específica de oligonucleótidos y polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios, y a composiciones y artículos de fabricación útiles para efectuar dichos métodos.

La presente invención se refiere adicionalmente a un método que proporciona la detección rápida y específica de oligonucleótidos y polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios en muestras, y a composiciones y artículos de fabricación útiles para efectuar dichos métodos.

En una realización, la presente invención se refiere a un sistema de detección de ácido nucleico que comprende una sonda oligonucleotídica aniónica, un transductor polimérico catiónico conjugado hidrosoluble y un mecanismo de amplificación fotónica intrínseco. El transductor polimérico catiónico conjugado hidrosoluble sirve también como contraión localizado, promoviendo la hibridación específica. Además, el transductor polimérico, cuando se combina con sondas de captura marcadas con un fluoróforo, proporciona una amplificación de señal y límites de detección mejorados.

El sistema de detección de ácido nucleico de la presente invención es capaz de detectar específica y rápidamente del orden de 20 oligonucleótidos monocatenarios. En una realización de la presente invención, los oligonucleótidos monocatenarios a detectar pueden extraerse de muestras clínicas.

Ventajosamente, el sistema de detección de ácido nucleico de la presente invención es adecuado para una evaluación rápida de la identidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), genes y patógenos sin necesidad de amplificación de ácido nucleico.

En una realización, la presente invención se refiere a un sistema de detección de ácido nucleico que comprende un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble; una sonda de captura oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo para formar una doble cadena con el politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble y una muestra sospechosa de contener un oligonucleótido diana complementario.

En una realización, la presente invención se refiere a un método para detectar moléculas de ácido nucleico de poca longitud que comprende: proporcionar un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble; poner en contacto el politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble con una sonda de captura oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo para formar una doble cadena y poner en contacto la doble cadena con una muestra sospechosa de contener un oligonucleótido diana complementario.

Resultarán evidentes alcances y aplicabilidades adicionales a partir de la descripción detallada dada a continuación en la presente memoria. Sin embargo, se entenderá que esta descripción detallada, aunque indica realizaciones preferidas de la invención, se da sólo a modo de ejemplo, puesto que resultarán evidentes diversos cambios y modificaciones para los expertos en la técnica.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La Figura 1 ilustra: A. Estructura química del polímero 1 y espectros de absorción UV-visible de (a) polímero de triple cadena 1/X1/Y1 (coincidencia perfecta), (b) polímero de doble cadena 1/[X1+Alexa Fluor (AF) 546] y (c) polímero de triple cadena 1/X1+AF546/Y1 (coincidencia perfecta) en agua a 55ºC. B. Espectros de fluorescencia con excitación a 420 nm, de (a) polímero de triple cadena 1/X1/Y1 (coincidencia perfecta), (b) polímero de doble cadena 1/[X1+AF546]; (c) polímero de triple cadena 1/X1+AF546/Y1 (coincidencia perfecta) en agua a 55ºC;

la Figura 2 ilustra la intensidad de fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a 572 nm en agua a 55ºC, con excitación a 420 nm, en función del número de copias de oligonucleótido diana de 20 unidades: (cuadrados) coincidencia perfecta; (círculos) dos desapareamientos; (triángulos) un desapareamiento;

la Figura 3 ilustra una descripción esquemática del mecanismo de detección de la amplificación de señal de la presente invención, basado en los cambios conformacionales del politiofeno catiónico y la transferencia de energía para una detección de ADN ultransensible, selectiva y rápida;

la Figura 4 ilustra: A. Intensidad de fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en función del número de copias de ADN genómico: (línea oscura) TAN 101 + ADN genómico de tipo silvestre (coincidencia perfecta); (línea clara) TAN 100 + ADN genómico de tipo silvestre (un desapareamiento). B. Intensidad de fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en función del número de copias de ADN genómico: (línea oscura) TAN 101 + ADN genómico mutado (coincidencia perfecta); (línea clara) TAN 100 + ADN genómico mutado (un desapareamiento);

la Figura 5 ilustra la intensidad de fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en agua pura a 55ºC, en función del número de copias de oligonucleótido diana de 20 unidades: (línea oscura) coincidencia perfecta; (línea clara) dos desapareamientos;

la Figura 6 ilustra la intensidad de fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm,...

 


Reivindicaciones:

1. Un sistema de detección de ácido nucleico que comprende:

una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo; y

un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra;

en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana.

2. Un kit que comprende un recipiente o recipientes que comprenden:

una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo; y

un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra;

en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana.

3. Un artículo de fabricación que comprende:

un vial que contiene una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo y que contiene un politiofeno catiónico crómico por afinidad que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra, en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana; o

envasados conjuntamente, un vial que contiene una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo y un vial que contiene un politiofeno catiónico crómico por afinidad que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra, en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana.

4. Un método de medida de la presencia de un polinucleótido diana que comprende:

proporcionar una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo y un politiofeno catiónico crómico por afinidad que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra, en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana;

poner en contacto un polinucleótido diana con dicha doble cadena neutra; y

medir los cambios en el espectro de absorción de dicha doble cadena neutra en presencia de dicho polinucleótido diana para cuantificar o analizar la complementariedad de dicho polinucleótido diana respecto a dicha sonda.

5. Un ensayo basado en el método de la reivindicación 4.

6. El sistema de detección de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido diana deriva del genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un amplicón.

7. El sistema de detección de ácido nucleico como se define en la reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su uso en el sistema.

8. El kit como se define en la reivindicación 2, en el que dicho polinucleótido diana deriva del genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un amplicón.

9. El kit como se define en la reivindicación 8, en el que dicho polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su uso en el sistema.

10. El artículo de fabricación como se define en la reivindicación 3, en el que dicho polinucleótido diana deriva del genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un amplicón.

11. El artículo de fabricación como se define en la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su uso en el sistema.

12. El método como se define en la reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido diana deriva del genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un amplicón.

13. El método como se define en la reivindicación 12, en el que dicho polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su uso en el sistema.


 

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