Método de amplificación de ácidos nucleicos, y reactivo y kit de reactivos para la utilización en el método.

Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno,

quecomprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en unamisma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antes de laamplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del molde de ácido nucleico diana,evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción deamplificación del ácido nucleico diana,

en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleicodiana por lo menos en la región de diseño del cebador,

en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñadopara hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleicodiana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado parahibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno,en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que seha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácidonucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes:

(a) la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentracióndel cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferioral de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de unmaterial de estándar interno y un ácido nucleico diana, y

(b) la concentración de un nucleótido de sustrato se fija en un valor superior al de la solución de reacción deamplificaciónutilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material deestándar interno y,

en el que, como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizadopara la amplificación del ácido nucleico diana se utilizan el cebador (1) y/o el cebador (2), en el que, al seleccionarsesucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de lasecuencia diana de un ácido nucleico molde hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico de molde, el cebador (1)comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5'hacia el lado 3', y

en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuartasecuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal delácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

Método de amplificación de ácidos nucleicos, y reactivo y kit de reactivos para la utilización en el método

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico en una muestra, en el que un ácido nucleico diana y un material de estándar interno se amplifican bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, así como un reactivo de ensayo o kit de reactivos utilizado para la reacción.

Antecedentes de la técnica Se ha desarrollado una diversidad de métodos para la amplificación de ácidos nucleicos como técnicas que permiten la detección de cantidades muy reducidas de ácidos nucleicos en una muestra. En particular, se ha utilizado un método en el que se lleva a cabo una amplificación isotérmica eficiente (por ejemplo el método LAMP) en una amplia diversidad de campos de ensayo a modo de técnica que permite la detección simple y rápida utilizando un aparato eficaz en cuanto a costes sin una función de control de la temperatura.

La presentes inventores han informado de que pueden cuantificarse los ácidos nucleicos en un intervalo de concentraciones de entre 103 y 109 copias/ensayo utilizando un sistema de detección LAMP que no implica la utilización de un material de estándar interno (Y. Mori et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 59:145157, 2004) . Debido a que esta técnica no utiliza un material de estándar interno, los resultados obtenidos con dicha técnica son cantidades relativas de ácidos nucleicos diana.

Desde entonces se ha informado de un método de cuantificación que implica la utilización de un material de estándar interno en el método LAMP (H. Tani et al., Analytical Chemistr y 79 (15) :5608-5613, 2007) . Este método implica la utilización de un material de estándar interno que presenta una secuencia similar a la del ácido nucleico diana, para amplificar simultáneamente el ácido nucleico diana y el material de estándar interno. Debido a que el intervalo cuantificable de concentraciones de dicho método es de tan sólo 104 a 108 copias/ensayo, resulta necesario diluir una muestra y repetir los ensayos una pluralidad de veces para someter a ensayo ácidos nucleicos de un intervalo amplio de concentraciones. APPLIED BIOSYSTEMS: 2007 MOLECULAR AND CELL BIOLOGY CATALOGUE (1 de septiembre de 2006, página 125) y "Taqman Exogenous Internal Positive Control Reagents VIC Probe Protocol" (2001, página 1, obtenido de Internet: URL: http://www.savethefrogs.com/chytrid/images/ABI-Exo-IPC-protocol.pdf [obtenido el ] dan a conocer los reactivos exógenos de control positivo interno. El documento WO nº 2006/034215 A2 da a conocer un método de desactivación de reacción multiplex en modo múltiple. Nurmi et al. (Anal. Chem. 74:3525-3532, 2002) dan a conocer una RT-PCR cuantitativa en tiempo real de alto rendimiento utilizando sondas de lantánidos y un ensayo de hibridación de temperatura dual. Hooríar et al. (J. Clin. Microbiol. 42 (5) :1863-1868, 2004) dan a conocer consideraciones prácticas para el diseño de controles internos de amplificación para ensayos de PCR diagnósticos.

Exposición de la invención En un sistema de detección que implica la utilización de un material de estándar interno, un producto de amplificación del material de estándar interno afecta a la reacción de amplificación del ácido nucleico diana. De esta manera, no puede someterse a ensayo con exactitud un ácido nucleico diana y esta desventaja se considera que es un problema habitual de las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que proporcionan una elevada eficiencia de amplificación. La presente invención pretende superar dicha desventaja y proporcionar un metodo que permita una amplificación estable de un material de estándar interno, manteniendo simultáneamente un valor de ensayo exacto para el ácido nucleico diana y un reactivo utilizado para el mismo.

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos con el fin de conseguir el objetivo anteriormente indicado. Como resultado, han encontrado que la influencia de un producto de amplificación de estándar interno impuesto en una reacción de amplificación de un ácido nucleico diana puede evitarse al no realizar una reacción de amplificación de un material de estándar interno simultáneamente a la reacción del ácido nucleico diana; es decir, llevando a cabo una reacción de amplificación de un material de estándar interno antes de la reacción del ácido nucleico diana. Lo anteiror ha conducido a completar la presente invención.

Concretamente, la presente invención proporciona (1) a (8) , a continuación.

(1) Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, que comprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antesde la amplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del ácido nucleico diana de molde, evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción de amplificación del ácido nucleico diana,

en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñado para hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado para hibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno, en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que se ha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácido nucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes:

(a) la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentración del cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de un material de estándar interno y el ácido nucleico diana, y

(b) la concentración del nucleótido de sustrato se fija a un valor superior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material de estándar interno, y en el que como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se utiliza el cebador (1) y/o (2) , en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico diana, el cebador (1) comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3', y

en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuarta secuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal del ácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2 complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

(2) El método de amplificación de ácidos nucleicos según (1) comprende las etapas de:

(a) añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b) llevar a cabo una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación de un ácido nucleico diana (en lo sucesivo denominado "cebador de estándar interno") y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana (en lo sucesivo denominado "cebador de ácido nucleico diana") bajo determinadas condiciones,... [Seguir leyendo]

1. Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, que comprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antes de la amplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del molde de ácido nucleico diana, evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción de amplificación del ácido nucleico diana, en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñado para hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado para hibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno, en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que se ha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácido nucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes:

(a) la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentración del cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de un material de estándar interno y un ácido nucleico diana, y

(b) la concentración de un nucleótido de sustrato se fija en un valor superior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material de estándar interno y,

en el que, como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se utilizan el cebador (1) y/o el cebador (2) , en el que, al seleccionarse sucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de la secuencia diana de un ácido nucleico molde hacia el extrem.

3. terminal del ácido nucleico de molde, el cebador (1) comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3', y en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuarta secuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extrem.

5. terminal del ácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2 complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

2. Método de amplificación de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a) añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b) llevar a cabo una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido que se utiliza para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación del material de estándar interno antes de llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

(c) llevar a cabo un ensayo por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del material de estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana.

3. Método de amplificación de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a) añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b) llevar a cabo una reacción de amplificaicón utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación de un ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

(c) llevar a cabo un ensayo en tiempo real por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del material de estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana y determinar la concentración o número de copia inicial del ácido nucleico diana en una muestra basándose en los resultados del ensayo y en la cantidad de material de estándar interno añadida.

4. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se cuantifica el ácido nucleico diana.

5. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que 5 comprende detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana.

6. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la reacción de amplificación es el método LAMP.

7. Reactivo de ensayo o kit de reactivos utilizado para llevar a cabo el método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende por lo menos los reactivos siguientes:

(a) un material de estándar interno de concentración o número de copia conocido, que presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador,

(b) un cebador oligonucleótido y/o cebador (2) según la reivindicación 1 para la amplificación de un material de

estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación del ácido nucleico diana, y

(c) un cebador oligonucleótido para la amplificación de un ácido nucleico diana.

8. Reactivo o kit de reactivos de ensayo según la reivindicación 7, que comprende además los reactivos 20 siguientes:

(a) una sonda oligonucleótida para detectar un material de estándar interno, y

(b) una sonda oligonucleótida para detectar un ácido nucleico diana.