Método de análisis de ácidos nucleicos.

Método de análisis de ácidos nucleicos, que comprende añadir un espécimen que contiene ácidosnucleicos a un soporte poroso que contiene un reactivo para la amplificación de ácidos nucleicos y someter un ácidonucleico diana a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos,

en el que:

a) un cebador y los demás reactivospara la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o

b) una polimerasa y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidosdentro de soportes porosos diferentes, o

c) la polimerasa, el cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamenteretenidos dentro de soportes porosos diferentes,

y se permite que los soportes porosos entre en contacto mutuo al utilizarlos en la amplificación.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2005/015493.

Solicitante: EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 4-19-9, TAITO, TAITO-KU TOKYO 110-8408 JAPON.

Inventor/es: HIRANO,TAKASHI, Mori,Yasuyoshi.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12M1/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › Equipos para enzimología o microbiología.
  • C12N15/00 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/543 G01N 33/00 […] › con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

PDF original: ES-2401879_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de análisis de ácidos nucleicos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de amplificación de ácidos nucleicos para la utilización sobre un soporte poroso, y se refiere además a un sistema total para la extracción, amplificación y detección de ácidos nucleicos que utiliza dicho soporte.

Antecedentes de la técnica Recientemente se ha incrementado la demanda general de ensayos del ADN. Con el fin de satisfacer esta demanda, se ha requerido el desarrollo de un sistema simple y compacto en el que pueda llevarse a cabo consistentemente la extracción de ácidos nucleicos a partir de un espécimen, seguido de la amplificación y detección de dicha amplificación.

En términos de análisis bioquímico para enzimas y componentes sanguíneos, se ha desarrollado un sistema de ensayo en fase sólida simple basado en química seca (ver, por ejemplo, el documento de patente nº 1) . En dicho sistema, se proporcionan reactivos que resultan necesarios para una reacción, en una matriz en un estado seco, de manera que tenga lugar la reacción utilizando la humedad de un espécimen añadido, que sirve como solvente. En el caso de un sistema de ensayo basado en química seca, puede medirse fácilmente un componente diana únicamente mediante aplicación de un punto con una cantidad minúscula de un espécimen sobre una fase sólida. De esta manera, debido a que dicho sistema presenta un uso práctico, se aplica ampliamente en el campo de la bioquímica.

Sin embargo, existen varios obstáculos que deben superarse para aplicar el sistema de química seca anteriormente indicado a ensayos de ácidos nucleicos. En primer lugar, convencionalmente se ha llevado a cabo la extracción, la amplificación y la detección de los ácidos nucleicos mediante sistemas diferentes. De esta manera, resulta difícil integrar dichos sistemas en uno solo. En particular, resulta necesaria un complicado ciclo a alta temperatura para la amplificación de los ácidos nucleicos mediante PCR o similar. Además, los reactivos, tales como un ácido nucleico molde, un enzima, un sustrato y un cebador deben someterse a un sistema de reacción con un elevado número de grados de libertad. Por lo tanto, en general, un sistema de reacción de fase sólida no resulta apropiado para los ensayos de ácidos nucleicos.

El documento de patente nº 6 da a conocer microcápsulas que encapsulan una mezcla de reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

Por otra parte, existen publicaciones sobre métodos en los que se permite que los ácidos nucleicos se adsorban a un filtro, fabricado en un tela no tejida, papel de filtro, hidroxiapatito o similar, de manera que se amplifican mediante el método LAMP (ver los documentos de patente nº 2 y nº 3) . De acuerdo con dichos métodos, la amplificación de los ácidos nucleicos se lleva a cabo permitiendo que los ácidos nucleicos se adsorban a un soporte sólido y añadiendo una solución de reacción de LAMP al mismo.

El método de LAMP es un método de amplificación de ácidos nucleicos desarrollado por los inventores de la presente invención y no requiere el complicado control de la temperatura que se considera esencial para la PCR. De esta manera, puede sintetizarse un producto de amplificación de cadena larga que presenta una estructura particular de repeticiones invertidas (que consiste de repeticiones alternativamente repetidas en la misma cadena) con una elevada eficiencia de amplificación (ver el documento no de patente nº 1 y el documento de patente nº 4) . Los inventores de la presente invención informan de un método para detectar la amplificación de los ácidos nucleicos sobre un sustrato hidrofílico, que comprende permitir que un precipitante de ácidos nucleicos se una a un producto de amplificación de LAMP (ver el documento de patente nº 5) . Sin embargo, el objetivo de dicho método es resolver problemas en términos de la separación de B/F en el ensayo de hibridación. De esta manera, dicho método no pretende establecer un sistema en el que la extracción, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos se lleven a cabo consistentemente sobre una fase sólida.

[Documento de patente nº 1] publicación de patente JP (Kokai) nº 5-80049 A (1993) [Documento de patente nº 2] publicación de patente JP (Kokai) nº 2004-201607 A [Documento de patente nº 3] nº WO 03/6650 [Documento de patente nº 4] nº WO 00/28082 [Documento de patente nº 5] publicación de patente JP (Kokai) nº 2004-141.159 A [Documento de patente nº 6] nº WO 03/078659 A3 [Documento no de patente nº 1] Tsugunori Notomi et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res.28 (12) : e63, 2000.

Exposición de la invención En estudios anteriores, los inventores de la presente invención han establecido una técnica en la que se lleva a cabo la extracción de ácidos nucleicos a partir de un espécimen sobre una fase sólida, de manera que un ácido nucleico diana se aplica sobre una fase sólida y se utiliza un método en el que se proporciona un complejo de producto de LAMP-polietilenimina (PEI) en una fase sólida de manera que se lleva cabo una detección específica de secuencia. De esta manera, en el caso de que resulte posible que tenga lugar una reacción de LAMP sobre una fase sólida, todas las etapas de extracción, amplificación y detección pueden llevarse a cabo sobre una fase sólida, y de esta manera puede construirse un sistema total para el análisis de ácidos nucleicos.

Específicamente, es un objetivo de la presente invención construir un sistema total para el análisis de ácidos nucleicos en el que pueda llevarse a cabo sobre un soporte sólido la totalidad de las etapas de extracción, amplificación y detección de un ácido nucleico.

Los inventores de la presente invención han confirmado que la reacción de LAMP tiene lugar mediante calentamiento de un trozo pequeño de papel de filtro, al que se aplica una cantidad minúscula de una solución de reacción de LAMP, a una temperatura predeterminada. Además, han confirmado que la reacción de LAMP tiene lugar mediante separación de una solución de reacción de LAMP en varios componentes, suministrando los componentes a una pluralidad de trozos de papel de filtro y solapando entre sí los trozos. Basándose en estos resultados, han llevado a cabo experimentos modelo referentes a un sistema total que combina un método de extracción en fase sólida, una reacción de LAMP en fase sólida y la detección de PEI en fase sólida. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, han conseguido detectar un ácido nucleico diana. Lo anterior ha conducido a completar la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a un método de análisis de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende añadir un espécimen que contiene ácidos nucleicos a un soporte sólido que preliminarmente contiene reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos y después llevar a cabo la amplificación de un ácido nucleico diana.

Según el método descrito anteriormente, resulta posible llevar a cabo consistentemente la extracción de ácidos nucleicos a partir de un espécimen que contiene ácidos nucleicos, una reacción de amplificación de ácidos nucleicos de un ácido nucleico diana y la detección de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos o el producto de la misma sobre el soporte poroso anteriormente indicado.

En dicho caso, en una etapa preliminar, el soporte poroso puede contener además un reactivo para la extracción de los ácidos nucleicos y/o un reactivo para la detección de los mismos.

En una realización, el método de la presente invención es un método de análisis de ácidos nucleicos según la reivindicación 3, que comprende las etapas siguientes, realizadas sobre un soporte poroso compuestos de dos o más capas:

1) extraer un ácido nucleico utilizando una capa de soporte poroso que contiene un reactivo para la extracción de ácidos nucleicos, 2) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para un ácido nucleico diana utilizando una capa de soporte poroso que contiene un reactivo para la amplificación de ácidos nucleicos, y 3) hibridar una sonda de ácidos nucleicos con el producto de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, permitir que un precipitante de ácidos nucleicos actúe sobre el híbrido que ha sido producido, de manera que forma un agregado, y detectar el ácido nucleico diana en un espécimen utilizando el agregado obtenido.

Según el método descrito anteriormente, en una etapa preliminar, el soporte poroso puede contener un precipitante de ácidos nucleicos y/o una sonda de ácidos nucleicos.

Según el método de la presente invención,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de análisis de ácidos nucleicos, que comprende añadir un espécimen que contiene ácidos nucleicos a un soporte poroso que contiene un reactivo para la amplificación de ácidos nucleicos y someter un ácido nucleico diana a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en el que: a) un cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o b) una polimerasa y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o c) la polimerasa, el cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, y se permite que los soportes porosos entre en contacto mutuo al utilizarlos en la amplificación.

2. Método de análisis de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende llevar a cabo consistentemente una extracción de ácidos nucleicos del espécimen, una reacción de amplificación para el ácido nucleico diana y la detección de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos o del producto de la misma sobre el soporte poroso.

3. Método de análisis de ácidos nucleicos, que comprende las etapas siguientes realizadas sobre un soporte poroso compuesto de dos o más capas: a) extraer un ácido nucleico utilizando una capa de soporte porosa, b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para un ácido nucleico diana utilizando una capa de soporte porosa que contiene un reactivo para la amplificación de ácidos nucleicos, y c) hibridar una sonda de ácidos nucleicos con el producto de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, permitir que un precipitante de ácidos nucleicos actúe sobre el híbrido que ha sido producido de manera que se forme un agregado, y detectar el ácido nucleico diana en un espécimen utilizando el agregado obtenido. en el que: i) un cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o ii) una polimerasa y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o iii) la polimerasa, el cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, y se permite que los soportes porosos entre en contacto mutuo al utilizarlos en la amplificación.

4. Método de análisis de ácidos nucleicos según la reivindicación 3, en el que el soporte poroso contiene un precipitante de ácidos nucleicos y/o una sonda de ácidos nucleicos.

5. Método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la polimerasa en estado seco resulta retenida dentro de los soportes porosos.

6. Método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la reacción de amplificación de ácidos nucleicos es una reacción LAMP.

7. Método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el soporte poroso está realizado en por lo menos un material seleccionado de entre el grupo que consiste de papel de filtro, membrana de nilón, éster de celulosa, celulosa, tela no tejida, tela tejida, algodón, poliuretano y plásticos sinterizados.

8. Método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el precipitante de ácidos nucleicos es por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidroxiapatito, polietilenimina, sulfato de protamina, poli-L-lisina y dietilaminoetil-dextrano.

9. Sistema de análisis de ácidos nucleicos para llevar a cabo consistentemente la extracción, amplificación y detección de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho sistema dos o más soportes porosos que contienen un reactivo para la amplificación de ácidos nucleicos, en el que: i) un cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o ii) una polimerasa y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes, o iii) la polimerasa, el cebador y los demás reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan separadamente retenidos dentro de soportes porosos diferentes.


 

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