DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE MÚLTIPLES ANALITOS.

Dispositivo y procedimiento para la determinación de múltiples analitos La invención se refiere a un dispositivo que comprende una pluralidad de compartimentos para muestra, en los que están inmovilizados respectivamente en cinco o más campos de medida discretos distintos elementos de reconocimiento bioquímicos o biológicos para el reconocimiento específico y unión de distintos analitos, estando inmovilizados los elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos en estos campos de medida bien directamente o mediante una capa adhesiva y dado el caso otras capas sobre la superficie de una guía de ondas óptica como componente de una plataforma sensora, que forma una superficie límite de estos compartimentos para muestra. A este respecto la plataforma sensora puede presentarse en distintas formas de realización. La invención se refiere también a un sistema analítico que comprende un dispositivo de acuerdo con la invención con distintas formas de realización de la plataforma sensora, un sistema óptico para la determinación de luminiscencia con al menos una fuente de luz de excitación y al menos un detector para el registro de la luz que sale de los campos de medida así como elementos de alimentación para poner en contacto una o varias muestras con los campos de medida sobre la plataforma sensora. Otro objeto de la invención son procedimientos de detección por luminiscencia con plataformas sensoras, sistemas ópticos y sistemas analíticos de acuerdo con la invención así como el uso de estos procedimientos para la sensórica de afinidad cuantitativa así como para otras aplicaciones distintas. Es objetivo de la presente invención proporcionar disposiciones para medida con una pluralidad de compartimentos de muestra de pequeño volumen, en los que se pueda determinar una pluralidad de analitos con un procedimiento de detección de alta sensibilidad. Para la determinación de una pluralidad de analitos hay divulgados en la actualidad sobre todo procedimientos en los que se realiza en las denominadas placas de microtítulos la detección de distintos analitos en compartimentos para muestra discretos o pocillos de estas placas. A este respecto lo más extendido son placas con una retícula de 8 x 12 pocillos sobre un soporte típicamente de aproximadamente 8 cm x 12 cm, en donde para el llenado de cada pocillo individual se requiere un volumen de algunos cientos de microlitros. Para aplicaciones múltiples sería deseable sin embargo determinar varios analitos en un único compartimentos para muestra con uso de un volumen de muestra lo más pequeño posible. En el documento US-P 5.747.274 se describen disposiciones para medida y procedimientos para el reconocimiento precoz de un infarto cardiaco, mediante la determinación de varios de al menos tres marcadores de infarto cardiaco, pudiendo realizarse la determinación de estos marcadores en compartimentos para muestra individuales o en uno conjunto, estando configurado en el último caso, en línea con la descripción dada, un compartimento para muestra individual como un canal de flujo ininterrumpido, cuya superficie límite forma por ejemplo una membrana, sobre la que están inmovilizados anticuerpos para los tres distintos marcadores. Sin embargo no hay indicio alguno de una preparación de varios compartimentos para muestra o canales de flujo de este tipo sobre un soporte conjunto. Además no se dan datos geométricos sobre el tamaño de las superficies de medida. En los documentos WO 84/01031, US-P 5.807.755, US-P 5.837.551 y US-P 5.432.099 se propone la inmovilización de elementos de reconocimiento específicos para los analitos en forma de pequeñas manchas con superficie en parte claramente por debajo de 1 mm 2 sobre soportes sólidos, para poder llevar a cabo mediante unión de una molécula de analito presente en pequeñas proporciones una determinación de concentración del analito dependiente solo del tiempo de incubación, pero en ausencia de un flujo continuo-, esencialmente independiente del volumen de muestra absoluto. Las disposiciones para medida descritas en los ejemplos de realización pertinentes se basan en la detección de fluorescencia en placas de microtítulos convencionales. A este respecto se describen también disposiciones en las que se miden manchas de hasta tres anticuerpos marcados con fluorescencia distintos en un pocillo de placa de microtítulos conjunta. Como consecuencia de las consideraciones teóricas indicadas en estos documentos de patente sería deseable una minimización del tamaño de la mancha. Sería limitante no obstante la altura de señal mínima que pudiese diferenciarse de la señal base. Para conseguir límites de detección más bajos se han desarrollado en años recientes múltiples disposiciones para medida, en los que la detección del analito se basa en este efecto de cambio con el campo evanescente, que está relacionado con la conducción de luz en una guía de ondas óptica, estando inmovilizados sobre la superficie de la guía de ondas elementos de reconocimiento bioquímicos o biológicos para el reconocimiento y unión específicos de la molécula de analito. Si se acopla una onda de luz en una guía de ondas óptica, que está rodeada por medios ópticamente más finos, es decir, medios con menor índice de refracción, entonces se conduce mediante reflexión total en la superficie límite de la capa de guía de ondas. En los medios ópticamente más finos aparece a este respecto una fracción de la energía electromagnética. Esta proporción se designa como campo evanescente o amortiguado transversalmente. La fuerza del campo evanescente es muy elevada dependiendo del grosor de la capa de guía de ondas propiamente así como de la relación de los índices de refracción de la capa de guía de ondas y de los medios que rodean. Con guías de onda finos, es decir, grosores de capa del mismo grosor o inferior que la longitud de onda conducida, se pueden diferenciar 2 ES 2 367 551 T3 modos discretos de luz conducida. Tales procedimientos tienen la ventaja de que está limitado el efecto de cambio con los analitos a la profundidad de penetración del campo evanescente en el medio rodeante, en la magnitud de algunos cientos de nanómetros, y se pueden evitar en gran medida señales distorsionantes desde la profundidad del medio. Las primeras disposiciones para medida propuestas de este tipo se basaban en guías de onda correspondientes multimodales autoportantes de una capa como, por ejemplo, fibras o plaquetas de plástico transparente o vidrio, con espesores de algunos cientos de micrómetros hasta varios milímetros. En el documento US-P 4.978.503 se describe una disposición para medida en la que se incorpora una muestra líquida mediante fuerzas capilares en una cavidad, estando configurada una pared lateral ópticamente transparente como guía de ondas multimodal autoportante, en donde está inmovilizado al menos sobre una parte de su superficie que da a la cavidad (parche) un elemento de reconocimiento bioquímico para el reconocimiento y unión de un analito de una muestra. Concretamente se describe en el documento de patente anterior la preparación de conjuntos de tales disposiciones con varios parches discretos, derivándose no obstante de las demás aclaraciones que los patches están provistos lateralmente con arcos de unión, para la unión de placas para fondo y de cubierta de capilares, estando separados entre sí de modo que tras aislamiento del conjunto cada capilar contenga solo un parche de elementos de reconocimiento inmovilizados. Además es desventajoso en esta disposición que no se prevea un cambio del líquido que llega a los capilares, lo que sería deseable por ejemplo en un conjunto de varias etapas. En el documento WO 94/27137 se describen disposiciones para medida en las que están inmovilizados parches con distintos elementos de reconocimiento, para la detección de distintos analitos sobre una guía de ondas de sustrato óptico autoportante (guía de ondas de una capa) con acoplamiento de luz en superficie frontal, realizándose la inmovilización espacial selectiva mediante reticulantes fotoactivables. Según la descripción dada pueden estar dispuestos varios parches en serie en canales de flujo paralelos conjuntos o compartimentos para muestra, extendiéndose los canales de flujo paralelos o compartimentos de muestra por toda la longitud del campo usado como sensor de la guía de ondas para evitar una afección de la conducción de luz en la guía de ondas. Sin embargo no se hace referencia alguna a la integración en dos dimensiones de una pluralidad de parches en compartimentos para muestras respecto a menores dimensiones, es decir, claramente menor de 1 cm 2 de superficie base. En una disposición similar se describen en el documento WO 97/35203 distintas formas de realización de una disposición en las que están inmovilizados respectivamente distintos... [Seguir leyendo]

1.- Dispositivo que comprende una guía de ondas óptica, plana, como componente de una plataforma sensora y una capa (g) en contacto con la plataforma sensora directamente o mediante un medio de sellado, de sellado estanco directamente o de sellado estanco mediante un medio de sellado, con una pluralidad de cavidades abiertas al menos hacia el lateral de la plataforma sensora, que forman una pluralidad de compartimentos de muestra en una disposición en dos dimensiones, presentando cada compartimiento de muestra una zona de guía de ondas, en un compartimento de muestra individual se inmovilizan elementos de reconocimiento bioquímicos o biológicos distintos para el reconocimiento específico y unión de distintos analitos en campos de medida discretos (d) y estos campos de medida se encuentran en interacción óptica con la luz de excitación de la guía de ondas óptica, como componente de una plataforma sensora, que forma una demarcación de dichos compartimentos de muestra, pudiendo clarificarse en los compartimientos de muestra líquidos de muestra o líquidos de reactivos alimentados y a continuación pueden alimentarse a los mismos compartimentos de muestra citados otros líquidos de muestra o líquidos reactivos, dado el caso sin etapa de lavado, estando integrados cinco o más campos de medida discretos (d) en dos dimensiones en el compartimiento de muestra y estando dispuestos en el campo conductor de ondas. 2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque los campos de medida se usan para la referenciación de los mismos parámetros químicos u ópticos en varios compartimentos de muestra distribuidos por la plataforma sensora, de modo que se puede determinar la distribución local de los citados parámetros químicos u ópticos sobre la plataforma sensora. 3. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la guía de ondas óptica como componente de la plataforma sensora es una guía de ondas óptica con una primera capa ópticamente transparente (a) sobre una segunda capa ópticamente transparente (b) con índice de refracción menor que la capa (a). 4. Dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque para la inmovilización de elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos se aplica sobre la capa ópticamente transparente (a) una capa que promueve la adhesión (f). 5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 3 a 4, caracterizado porque se realiza el acoplamiento de luz de excitación en los campos de medida (d) con ayuda de una o varias estructuras de rejilla (c), que están formadas en la capa ópticamente transparente (a). 6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque se realiza el acoplamiento de luz guiada en la capa ópticamente transparente (a) con ayuda de estructuras de rejilla (c), que está formadas en la capa ópticamente transparente (a). 7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque entre la capa ópticamente transparente (a) y los elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos inmovilizados está dispuesta un capa de metal fina, preferiblemente de oro o plata, dado el caso sobre una capa dieléctrica adicional con índice de refracción menor que la capa (a), por ejemplo de sílice o de fluoruro de magnesio, seleccionándose el espesor de la capa de metal y de la capa intermedia eventualmente adicional de modo que se pueda excitar un plasmón de superficie con la longitud de ondas de excitación y/o de longitud de onda de luminiscencia. 8. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque las estructuras de rejilla (c) y dado el caso estructuras de rejilla (c) presentes adicionalmente se encuentran fuera de la zona de los compartimentos de muestra. 9. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque las estructuras de rejilla (c) y dado el caso estructuras de rejilla (c) presentes adicionalmente se extiende por la zona de varios o todos los compartimentos de muestra. 10. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el material de la capa (g) de sellado estanco que se encuentra en contacto con la plataforma sensora en la superficie soporte respecto a la plataforma sensora es transparente al menos en la profundidad de penetración del campo evanescente tanto para la radiación de excitación como también para la radiación de luminiscencia de excitación. 11. Dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la capa (g) se encuentra presente como dos capas, en las que la primera capa se pone en contacto con la superficie de la plataforma sensora, siendo transparente tanto para la radiación de excitación como también para la radiación de luminiscencia excitada, mientras que la capa que se encuentra a continuación a distancia de la plataforma sensora es absorbente en el campo espectral de la radiación de excitación y de la radiación de luminiscencia excitada. 12. Dispositivo según la reivindicación 9, caracterizado porque el material de la capa (g) de sellado en profundidad que se encuentra en contacto con la plataforma sensora es absorbente en la región espectral de la radiación de excitación y de la radiación de luminiscencia excitada. 13. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el material de la capa (g) de sellado estanco que se encuentra en contacto con la plataforma sensora es autoadherente en la plataforma sensora. 14. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el material de la capa (g) de sellado estanco que se encuentra en contacto con la plataforma sensora se compone de un polisiloxano. 15. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque en un compartimento de muestra se encuentran 5-1000, preferiblemente 10-400 campos de medida. 16. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque un campo de medida individual en un compartimento de muestra ocupa una superficie de 0,001 a 6 mm 2 , presentando los campos de medida igual o distinto tamaño. 17. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque los compartimentos de muestra presentan respectivamente un volumen de 100 nl a 1 ml. 18. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 17 caracterizado porque los compartimentos de muestra se encuentran cerrados por el lateral opuesto a la capa ópticamente transparente (a), con excepción de aberturas de entrada y/o salida para la alimentación o la salida de muestras y dado el caso reactivos adicionales, y la alimentación o la salida de muestras y dado el caso reactivos adicionales en un sistema de flujo cerrado, donde en el caso de que la alimentación de líquido se realice en varios campos de medida o segmentos con aberturas de entrada y salida conjuntas estos se dirigen preferiblemente a modo de columnas o en filas. 19. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la alimentación de las muestras y dado el caso de reactivos adicionales se realiza en microcanales paralelos o cruzados, bajo la acción de diferencias de presión o por potenciales eléctricos o electromagnéticos. 20. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque los compartimentos de muestra presentan aberturas para el suministro o eliminación dirigido localmente de las muestras u otros reactivos en el lateral opuesto a la capa ópticamente transparente (a). 21. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque están previstos compartimentos para los reactivos que se humedecen y se ponen en contacto con los campos de medida durante el procedimiento para la detección de analito. 22. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque sobre la plataforma sensora se aplican marcados reconocibles óptica o mecánicamente para facilitar el ajuste en un sistema óptico y/o para la unión con la capa (g) que contiene los recesos para los compartimentos de muestra. 23. Sistema analítico para la determinación de una o varias luminiscencias con - al menos una fuente de luz de excitación - un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 22, ES 2 367 551 T3 - al menos un detector para el registro de al menos uno o varios campos de medida (d) sobre la luz que sale de la plataforma sensora. 24. Sistema analítico según la reivindicación 23 con un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque la luz de excitación que sale de al menos una fuente de luz es coherente y se irradia con el ángulo de resonancia para el acoplamiento en la capa ópticamente transparente (a) sobre uno o varios campos de medida. 25. Sistema analítico según la reivindicación 24, caracterizado porque como fuentes de luz de excitación se usan dos o más fuentes de luz coherentes con igual o diferentes longitudes de onda de emisión. 26. Sistema analítico según una de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque para la detección se usa al menos un detector de resolución espacial. 27. Sistema analítico según una de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque entre una o más fuentes de luz de excitación y la plataforma sensora y/o entre la plataforma sensora citada y el o los detectores se usan componentes ópticos del grupo que comprende lentes o sistemas de lentes para la conformación de los haces de luz transmitidos, espejos planos o curvados para la desviación y dado el caso adicionalmente conformación de haces de luz, prismas para la derivación y dado el caso para la distribución espectral de haces de luz, espejos dicroicos para la derivación 21 ES 2 367 551 T3 selectiva espectral de partes de los haces de luz, filtros neutros para la regulación de intensidad de luz transmitida, filtros ópticos o monocromadores para la transmisión selectiva espectral de partes de haces de luz o elementos selectivos para polarización para la selección de direcciones de polarización discretas de la luz de excitación o luminiscencia. 28. Sistema analítico según una de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque la irradiación de la luz de excitación y detección de la luz de emisión se realizan a partir de uno o más campos de medida secuencialmente para compartimentos de muestra individuales o múltiples. 29. Sistema analítico según la reivindicación 28, caracterizado porque se realiza la excitación secuencial y detección utilizando componentes móviles ópticos que se forma del grupo de espejos, prismas de derivación y espejos dicroicos. 30. Sistema analítico según la reivindicación 29, caracterizado porque se realiza la excitación secuencial y detección con uso de un escáner esencialmente de control del ángulo y foco. 31. Procedimiento para la detección por luminiscencia de uno o varios analitos en una o varias muestras en al menos cinco o más campos de medida separados especialmente por medio de un dispositivo o un sistema analítico según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 30, caracterizado además porque se suministra a los compartimentos de muestra líquidos de muestra, se conduce luz de excitación a los campos de medida, excitando de este modo sustancias que pueden emitir luminiscencia en las muestras o sobre los campos de medida para la luminiscencia y midiendo la luminiscencia emitida. 32. Procedimiento según la reivindicación 31 con un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque se miden simultáneamente (1) la luminiscencia emitida isotrópicamente o (2) la luminiscencia acoplada en la capa ópticamente transparente (a) y desacoplada con la estructura de rejilla (c) o luminiscencias de ambas partes (1) y (2). 33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 31 a 32, caracterizado porque para la generación de luminiscencia se usa un colorante de luminiscencia o nanopartículas luminiscentes como etiqueta de luminiscencia, que se puede excitar y emitir con una longitud de onda entre 300 nm y 1100 nm. 34. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque la etiqueta de luminiscencia en los analitos o en un ensayo competitivo está unida a un análogo del analito o a un ensayo múltiple en una pareja de unión de elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos o en los elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos. 35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 34, caracterizado porque se usan una segunda o más etiquetas de luminiscencia con longitudes de onda de excitación iguales o diferentes a la primera etiqueta de luminiscencia y longitudes de onda de emisión iguales o diferentes. 36. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado porque se puede excitar la segunda o incluso posterior etiqueta de luminiscencia en la misma longitud de onda que el primer colorante de luminiscencia, pero que emiten con otras longitudes de onda. 37. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado porque los espectros de excitación y espectros de emisión de los colorantes de luminiscencia usados sólo se solapan mínimamente o casi nada. 38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 31 a 37, caracterizado porque además de la determinación de una o más luminiscencias, se determinan cambios del índice de refracción efectivo en los campos de medida. 39. Procedimiento según una de las reivindicaciones 31 a 38, caracterizado porque se llevan a cabo con polarización selectiva una o varias luminiscencias y/o determinaciones de señales de luz en las longitudes de onda de excitación. 40. Procedimiento según la reivindicación 39, caracterizado porque se miden una o varias luminiscencias con otra polarización distinta de la de la luz de excitación. 41. Uso del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 22 o del sistema analítico según una de las reivindicaciones 23 a 30, para el análisis cuantitativo o cualitativo para la determinación de analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de cribado en la investigación de fármacos, la química combinatoria, desarrollo clínico y preclínico, para estudios de unión a tiempo real y para la determinación de parámetros cinéticos en cribado por afinidad y en la investigación, para determinaciones de analito cualitativas y cuantitativas, de forma particular para la analítica de ADN y ARN y la determinación de diferencias genómicas o proteómicas en el genoma, como por ejemplo polimorfismo de nucleótidos individuales, para la medida de efectos metabólicos de ADN en proteína, para la determinación de mecanismos de control para la expresión de ARNm y para la (bio)síntesis de proteínas, para la generación de estudios de toxicidad así como para la determinación de perfiles de expresión, de 22 forma particular para la determinación de marcadores biológicos y químicos, como ARNm, proteínas, péptidos o sustancias (mensajeras) orgánicas de bajo peso molecular, así como para la detección de anticuerpos, antígenos, patógenos o bacterias en la investigación y desarrollo de productos farmacéuticos, de diagnóstico humano y veterinario, de la investigación y desarrollo de productos agroquímicos, de diagnóstico de plantas sintomático y 5 presintomático, para la estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección de medicamentos terapéuticos, para la detección de patógenos, sustancias dañinas y agentes patógenos, de forma particular de salmonela, priones, virus y bacterias, de forma particular en analítica de alimentos y ambientales. ES 2 367 551 T3 23 ES 2 367 551 T3 Figura 1 24