Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:

a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3', un punto inicial para una síntesis de lacadena complementaria que comienza en el lado 3' de una de las cadenas que componen la secuencia denucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una regiónarbitraria del producto de la síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como punto inicial;

b) un segundo cebador que (i) se aparea en su extremo 3' con la región del lado 3' de una secuencia denucleótidos objetivo en un producto de elongación del primer cebador y (ii) tiene en su lado 5' una secuencia denucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadenacomplementaria de este cebador, en la que el extremo 3' del segundo cebador proporciona un punto inicialpara síntesis de cadena complementaria;

c) un primer cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para ellado 3' de un molde del primer cebador;

d) un segundo cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria parael lado 3' de un molde del segundo cebador

e) al menos uno de un primer cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadenacomplementaria usando un producto de prolongación del primer cebador como un molde, en el que el puntoinicial del primer cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el puntoinicial del primer cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del primer cebador en elproducto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria que se aparea con el primer cebador, y unsegundo cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando unproducto de prolongación del segundo cebador como un molde, en el que el punto inicial del segundo cebadorbucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del segundo cebadorbucle está entre una región correspondiente a la secuencia del segundo cebador en el producto deprolongación del segundo cebador y la región arbitraria que se aparea con el segundo cebador;

f) una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria con desplazamiento de cadenasacompañantes; y,

g) un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

Procedimiento para sintetizar polinucleótidos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para sintetizar polinucleótidos.

Técnica anterior

Los procedimientos de síntesis de ácidos nucleicos dependientes de un molde que usan el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido el principal impulso en la investigación en los campos de las biociencias en los últimos años. El procedimiento de la PCR ha hecho posible amplificar exponencialmente ácidos nucleicos compuestos por una secuencia de nucleótidos complementaria a un molde mediante el uso de una pequeña cantidad de ácido nucleico bicatenario como molde. Actualmente, la PCR se usa ampliamente como herramienta para la clonación y la detección de genes. En el procedimiento de la PCR, se usa un conjunto de cebadores que comprenden secuencias de nucleótidos complementarias a ambos extremos de una secuencia de nucleótidos diana. Uno de los cebadores está diseñado para que se aparee con el producto de prolongación generado por el otro cebador. De este modo, tiene lugar una reacción de síntesis en la que se repiten el apareamiento con un producto de prolongación mutuo y la síntesis de una cadena complementaria, que permite que se produzca una amplificación exponencial.

En el procedimiento de la PCR, es esencial el control de la temperatura. Se debe usar un aparato de reacción especial que cuente con este complicado control de la temperatura. De este modo, es difícil realizar una PCR en las zonas hospitalarias destinadas a los pacientes o en las zonas exteriores de los hospitales. Además, la mejora de la especificidad de la reacción ha supuesto un problema importante para las reacciones de síntesis de cadenas complementarias conocidas. Por ejemplo, en el procedimiento de la PCR, cuando se usa un producto de la síntesis de la cadena complementaria como un molde nuevo, la región con la que se aparea el molde no es una secuencia de nucleótidos derivada de la muestra en el sentido estricto de la palabra, sino que se trata simplemente de una copia de la secuencia de nucleótidos del cebador. De este modo, lo común es que resulte difícil reconocer las pequeñas diferencias que existen en las secuencias de nucleótidos usando un cebador de PCR.

Como procedimiento para resolver estos problemas, se inventó el procedimiento LAMP (amplificación isotérmica mediada por un bucle) (Nucleic Acid Res. 2000, Vol. 28, n.º 12 e63, WO 00/28082) . El procedimiento LAMP hace posible el apareamiento con un polinucleótido molde de su propio extremo 3’ para que sirva como punto de partida para la síntesis de la cadena complementaria, a la vez que también permite una reacción de síntesis de la cadena complementaria isotérmica combinando un cebador que está apareado con el bucle formado en este momento. Además, en el procedimiento LAMP, como el extremo 3’ se aparea con una región derivada de la muestra, hay un mecanismo de verificación de las secuencias de nucleótidos que funciona reiteradamente. Como consecuencia de ello, se ha hecho posible identificar incluso las diferencias pequeñas en las secuencias de nucleótidos.

Cuando se detecta una secuencia de nucleótidos diana en base a una reacción de síntesis de la cadena complementaria tal como LAMP o PCR, existe una estrecha relación entre el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción y la sensibilidad de la detección. En otras palabras, el hecho de permitir que la reacción tenga lugar durante el mayor tiempo posible hasta que la reacción se estabiliza es una condición necesaria para conseguir una elevada sensibilidad de detección. En el caso de las reacciones de síntesis de cadenas complementarias conocidas como LAMP y PCR, la reacción se estabiliza en aproximadamente 1 hora. En otras palabras, se puede decir que es necesario un tiempo de reacción de aproximadamente 1 hora para obtener la sensibilidad máxima. Aunque un tiempo de reacción de 1 hora no es tan elevado, todavía sería más útil que se realizara en un tiempo de reacción incluso más corto sin sacrificar la sensibilidad de la detección ni la facilidad del procedimiento.

Tras la identificación del genoma, la ciencia está entrando en la era post–genoma. Existe una necesidad cada vez mayor de analizar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y la función de los genes, así como el diagnóstico génico basado en los resultados de aquellos análisis. De este modo, el desarrollo de una tecnología que permita analizar con mayor exactitud y rapidez las secuencias de los nucleótidos de los genes está cobrando importancia no sólo en términos de llevar a cabo análisis funcionales con rapidez, sino además con respecto a la aplicación práctica de los resultados de los análisis de las funciones de los genes en los entornos clínicos reales.

Revelación

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar medios que puedan llevar a cabo rápidamente una reacción de síntesis de una cadena complementaria mediante el uso de un polinucleótido como molde.

El inventor realizó una amplia investigación sobre las condiciones de la reacción para la síntesis de cadenas complementarias para resolver los problemas anteriores. Como resultado de ello, se descubrió que la combinación de los cebadores usados para la síntesis de la cadena complementaria y el extremo 3’ que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria estaba íntimamente relacionada con la velocidad de la reacción de síntesis de la cadena complementaria. Además, se reveló que es posible mejorar la eficacia de la reacción de síntesis de la cadena complementaria mediante la combinación de un polinucleótido molde que tenga una estructura específica con un cebador capaz de producir el punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en una ubicación específica de este polinucleótido, llegando de ese modo a la finalización de la presente invención. Concretamente, la presente revelación se refiere al siguiente procedimiento de síntesis de polinucleótidos y la

aplicación del mismo.

[1] Un procedimiento para sintetizar un polinucleótido que comprende las etapas de mezclar los siguientes elementos 1 a 5 e incubar en condiciones que permiten síntesis de cadena complementaria dependiente de molde usando la ADN-polimerasa en 4:

1: un polinucleótido de molde que:

(a) tiene una secuencia de nucleótidos diana que comprende al menos un conjunto de secuencias de nucleótidos complementarias,

(b) forma un bucle capaz de apareamiento de bases cuando la secuencia de nucleótidos complementaria de (a) hibrida.

(c) forma un bucle por el apareamiento de su extremo 3’ consigo mismo y

(d) cuyo extremo 3’ apareado consigo mismo puede ser un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usándose a sí mismo como molde;

2: al menos dos tipos de cebadores que proporcionan puntos iniciales para la síntesis de cadena complementaria en diferentes localizaciones en el bucle polinucleotídico de molde;

3: al menos un tipo de cebador que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria en

una localización diferente de los cebadores de 2 en un bucle formado por polinucleótido de molde y/o un producto de prolongación producido por el apareamiento de los cebadores de 2 al polinucleótido de molde;

4: una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria acompañando desplazamiento de cadena; y,

5: un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

[2] El procedimiento de [1], en el que dicho polinucleótido molde tiene en su extremo 5’ una secuencia de nucleótidos complementaria con una región arbitraria de su propia secuencia de nucleótidos.

[3] El procedimiento de [2], en el que dicho polinucleótido de molde se produce por las siguientes etapas de:

a) aparear un primer cebador a una secuencia de polinucleótidos diana y realizar una reacción de síntesis de cadena complementaria usando esto como un punto inicial, en el que dicho primer cebador (i) puede

proporcionar en el extremo 3’ un punto inicial para síntesis de cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana y (ii)... [Seguir leyendo]

1. Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:

a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3’, un punto inicial para una síntesis de la cadena complementaria que comienza en el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de 5 nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria del producto de la síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como punto inicial;

b) un segundo cebador que (i) se aparea en su extremo 3’ con la región del lado 3’ de una secuencia de nucleótidos objetivo en un producto de elongación del primer cebador y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadena

complementaria de este cebador, en la que el extremo 3’ del segundo cebador proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria;

c) un primer cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para el lado 3’ de un molde del primer cebador;

d) un segundo cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para 15 el lado 3’ de un molde del segundo cebador

e) al menos uno de un primer cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del primer cebador como un molde, en el que el punto inicial del primer cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del primer cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del primer cebador en el 20 producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria que se aparea con el primer cebador, y un segundo cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del segundo cebador como un molde, en el que el punto inicial del segundo cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del segundo cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del segundo cebador en el producto de

prolongación del segundo cebador y la región arbitraria que se aparea con el segundo cebador;

f) una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria con desplazamiento de cadenas acompañantes; y,

g) un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

2. El equipo de la reivindicación 1, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.

3. El equipo de la reivindicación 1, en el que el primer cebador y/o el segundo cebador comprende una secuencia de verificación en el lado 5’.

4. El equipo de la reivindicación 3, en el que el primer cebador bucle comprende en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región dispuesta en el lado 5’ del primer cebador, o una secuencia de verificación que incluye un nucleótido para proporcionar el apareamiento erróneo, en el que la secuencia de

verificación del primer cebador bucle difiere de la secuencia de verificación en el lado 5’ del primer cebador y/o del segundo cebador.

5. Un conjunto de cebadores para amplificación de una secuencia de nucleótidos diana que comprende: un primer cebador, un segundo cebador, un primer cebador externo, un segundo cebador externo y al menos uno de un primer cebador bucle y un segundo cebador bucle como se definen en la reivindicación 1

6. El conjunto de cebadores de la reivindicación 5, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.