Conjunto de cebadores de oligonucleótido, caracterizado por ser capaz de amplificar una secuencia de nucleótidos específica para el virus de la gripe aviar H5 y que consiste en un conjunto de cebadores internos que comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos a) y b),

y, un conjunto de cebadores externos que comprende los cebadores de oligonucleótido 5 que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos c) y d):

(a) 5'-(una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2)-(una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases)-(la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3)-3';

(b) 5'-(la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5)-(una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases)-(una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6)-3'.

(c) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, y

(d) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10.

Método de detección del virus de la gripe aviar H5

Campo técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores de oligonucleótido para la detección de un virus de la gripe aviar H5, a un método para la detección de un virus de la gripe aviar H5 usando el conjunto de cebadores, a un método para el diagnóstico de gripe, y a un kit para el diagnóstico de gripe.

Antecedentes de la técnica

La gripe, que es una infección respiratoria viral epidémica, afecta a personas de la amplia franja de edad desde lactantes hasta los ancianos y a menudo es mortal. Los virus de la gripe aviar H5 controvertidos actualmente que infectan pájaros no infectan originariamente a seres humanos. Sin embargo, la infección humana con los virus se confirmó en Hong Kong en 1997 y fue prevalente con el resultado de que murieron 6 de 18 pacientes. Afortunadamente, a partir de entonces no se ha confirmado ninguna infección humana. Sin embargo, se confirmó infección humana en Tailandia y Vietnam en 2004 con el resultado que murieron 8 y 16 personas en Tailandia y Vietnam, respectivamente.

Los virus de la gripe aviar altamente patógenos incluyen un subtipo H7, además del subtipo H5. Los subtipos H7 se dividen ampliamente en subtipos euroasiáticos y americanos según las secuencias de los mismos. Según los informes, los virus de la gripe aviar H7 produjeron la muerte de 1 persona cuando fueron prevalentes en los Países Bajos en 2003, y también fueron prevalentes en los EE.UU. desde 2003 hasta 2004.

Actualmente se ha usado un kit para el diagnóstico rápido de un virus de la gripe humano A en la detección de virus de la gripe aviar. Sin embargo, la identificación de un subtipo de virus que provoca infección ha requerido un análisis detallado adicional tal como el análisis antigénico o prueba genética de virus separados.

El diagnóstico usando el cultivo y la separación de virus que produce resultados precisos requiere varios días y por tanto, no puede realizarse rápidamente. Existen varios métodos que pueden proporcionar un diagnóstico rápido en comparación con la separación de virus. Entre ellos, se ha mencionado que un método de RT-PCR tiene alta sensibilidad de detección en comparación con otros métodos. Sin embargo, según algunos informes, los métodos de RT-PCR dados a conocer actualmente no pueden detectar los virus con alta sensibilidad en comparación con la infectividad viral. Por tanto, la infección con un virus de la gripe aviar no puede negarse incluso si un resultado es negativo en una prueba usando el método de RT-PCR.

Por tanto, se ha demandado un método de prueba que puede detectar rápidamente un virus de la gripe aviar H5 o H7 con alta sensibilidad.

Documento de patente 1: publicación de patente europea n.º 1310565

Documento de patente 2: traducción de PCT publicada japonesa n.º 2004-509648

Documento de patente 3: WO 02/29118 A

Documento de patente 4: EP-A-1 020 534

Documento distinto a patente 1: Lau LT., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 313, págs. 336-342 (2004)

Documento distinto a patente 2: Shan S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 302, págs. 377-383 (2003)

Documento distinto a patente 3: Collins RA., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 300, págs. 507-515 (2003)

Documento distinto a patente 4: Lee MS., et al., J. Virol. Methods, vol. 97, págs. 13-22 (2001)

Documento distinto a patente 5: Munch M., et al., Arch. Virol., vol. 146, págs. 87-97 (2001)

Documento distinto a patente 6: THAI H T C et al, "Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respirator y syndrome coronavirus" JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 42, n.º 5, 1 de mayo de 2004 () . páginas 1956-1961.

Documento distinto a patente 7: YOSHIKAWA TETSUSHI ET AL. "Detection of human herpesvirus 7 DNA by loopmediated isothermal amplification." JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY; vol. 42, n.º 3, marzo de 2004 (032004) , páginas 1348-1352.

Documento distinto a patente 8: PARIDA MANMOHAN ET AL: "Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile Virus." JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 42. n.º 1, enero de 2004 (01-2004) , páginas 257-263.

Documento distinto a patente 9: NOTOMI ET AL. "loop-mediated isothermal amplification of DNA" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 28, n.º 12, 1 de diciembre de 2000 () , páginas i-vii.

El documento de patente 3 y los documentos distintos a patente 1 y 3 se refieren a la detección de virus H5 o H7 de la gripe aviar basándose en la amplificación de una parte del gen de la hemaglutinina como el gen diana.

Los documentos distintos a patente 6-9 y el documento de patente 4 se refieren al método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y se dan a conocer los principios del método de LAMP (documento de patente 4 y documento distinto a patente 9) así como el uso de dicho método para la detección del coronavirus SARS (documento distinto a patente 6) , del virus del herpes humano 7 (documento distinto a patente 7) y del virus del Nilo occidental (documento distinto a patente 8) .

Descripción de la Invención Problemas a resolver por la Invención Los presentes inventores han realizado estudios concienzudos para resolver los problemas y han completado por consiguiente la presente invención descubriendo que puede detectarse un virus de la gripe aviar H5 con alta sensibilidad preparando cebadores de oligonucleótido que se hibridan con una secuencia de nucleótidos específica para el virus de la gripe aviar H5 y amplificando la secuencia de nucleótidos específica para el virus de la gripe aviar H5 mediante un método de LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle) .

Medios para resolver los problemas Específicamente, la presente invención proporciona los siguientes puntos (1) a (6) :

(1) Un conjunto de cebadores de oligonucleótido, caracterizado por poder amplificar una secuencia de nucleótidos específica para el virus de la gripe aviar H5 y que consiste en un conjunto de cebadores internos que comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos a) y b) , y, un conjunto de cebadores externos que comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos c) y d) :

(a) 5'- (una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2) - (una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases) - (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3) -3';

(b) 5'- (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5) - (una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases) - (una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6) -3'.

(c) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, y

(d) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10.

(2) Un conjunto de cebadores de oligonucleótido según (1) , en el que el conjunto de cebadores internos comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9.

(3) Un conjunto de cebadores de oligonucleótido según (2) , que comprende además un conjunto de cebadores de bucle que comprende cebadores de oligonucleótido que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

(4) Un método para la detección de un virus de la gripe aviar H5, caracterizado porque comprende realizar una reacción de amplificación de una región de ácido nucleico diana de un virus de la gripe aviar H5 mediante el uso de un conjunto de cebadores de oligonucleótido según uno cualquiera de (1) a (3) , en el que la reacción de amplificación es un método de LAMP.

(5) Un método para el diagnóstico de gripe, caracterizado porque comprende detectar la amplificación de una región de ácido nucleico diana de un virus de la gripe aviar H5 mediante el uso de un conjunto de cebadores de oligonucleótido según uno cualquiera de (1) a (3) , y diagnosticar de ese modo la presencia o ausencia de infección con el virus de la gripe aviar H5.

(6) Un kit para el diagnóstico de gripe, caracterizado porque comprende un conjunto de cebadores de oligonucleótido según uno cualquiera de (1) a (3) .

Efecto de la invención

Según la presente invención, un virus de la gripe aviar H5 puede detectarse... [Seguir leyendo]

1. Conjunto de cebadores de oligonucleótido, caracterizado por ser capaz de amplificar una secuencia de nucleótidos específica para el virus de la gripe aviar H5 y que consiste en un conjunto de cebadores internos que comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos a) y b) , y, un conjunto de cebadores externos que comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las siguientes secuencias de nucleótidos c) y d) :

(a) 5'- (una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.

2. (una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases) - (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.

3. 3';

(b) 5'- (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.

5. (una secuencia de nucleótidos arbitraria que tiene de 0 a 50 bases) - (una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.

6. 3'.

(c) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, y

(d) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10.

2. Conjunto de cebadores de oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores internos comprende los cebadores de oligonucleótido que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9.

3. Conjunto de cebadores de oligonucleótido según la reivindicación 2, que comprende además un conjunto de cebadores de bucle que comprende cebadores de oligonucleótido que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

4. Método para la detección de un virus de la gripe aviar H5, caracterizado porque comprende realizar una reacción de amplificación de una región de ácido nucleico diana de un virus de la gripe aviar H5 mediante el uso de un conjunto de cebadores de oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la reacción de amplificación es un método de LAMP.

5. Método para el diagnóstico de gripe, caracterizado porque comprende detectar la amplificación de una región de ácido nucleico diana de un virus de la gripe aviar H5 mediante el uso de un conjunto de cebadores de oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y diagnosticar de ese modo la presencia o ausencia de infección con el virus de la gripe aviar H5.

6. Kit para el diagnóstico de gripe, caracterizado porque comprende un conjunto de cebadores de oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.