Método para amplificar y detectar un ácido nucleico usando ácido nucleico bicatenario como molde.

Metodo para amplificar y detectar una secuencia de nucleotidos diana en una muestra,

comprendiendo el metodo llevar a cabo un metodo de amplificacion y observar si se ha generado o no el producto de la reaccion de amplificacion,

en el que el metodo de amplificacion es un metodo para la amplificacion de acido nucleico a temperatura constante usando acido nucleico bicatenario como molde, en el que una hebra del acido nucleico bicatenario comprende regiones F3c, F2c, F1c, R1, R2 y R3 del lado 3' del acido nucleico bicatenario y en el que la otra hebra del acido nucleico bicatenario comprende las regiones complementarias F3, F2, F1, R1c, R2c y R3c del lado 5' del acido nucleico bicatenario, en el que el metodo comprende:

a) incubar un molde de acido nucleico bicatenario y un cebador interno RA constituido por regiones R1c y R2, mediante lo cual la region R2 se hibrida con la region R2c en el molde de acido nucleico bicatenario en presencia de una ADN polimerasa que cataliza una reaccion de sintesis de hebra complementaria que acompana a un desplazamiento de hebra, en condiciones en las que el acido nucleico bicatenario es inestable usando el cebador interno RA como origen, de tal manera que una region F2c del acido nucleico molde diana que va a hibridarse por un cebador interno FA constituido por regiones F1c y F2, mediante lo cual la region F2 se hibrida con la region F2c en el molde de acido nucleico bicatenario que puede amplificar el acido nucleico molde a temperatura constante cuando la hebra individual liberada se hibrida de manera intramolecular con si mismo

b) hibridar un cebador externo F3 con la region F3c de la hebra individual desplazada en la etapa a), que se coloca en condiciones tales que puede experimentar apareamiento de bases;

c) llevar a cabo la sintesis de hebra complementaria usando el cebador externo F3 como origen de sintesis, mediante lo cual el producto extendido sintetizado usando el cebador interno FA como origen se desplaza y se libera como una hebra individual; y

d) usar la hebra individual como molde, el cebador interno RA y el cebador externo R3, mediante lo cual la region R2 se hibrida con la region R2c, y R3 se hibrida con la region R3c en la hebra individual desplazada en la etapa c) e iniciar la sintesis de hebra complementaria.

Método para amplificar y detectar un ácido nucleico usando ácido nucleico bicatenario como molde Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para sintetizar un ácido nucleico, a temperatura constante, que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un ácido nucleico bicatenario molde, según las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

El método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) dependiente de molde para sintetizar ácido nucleico ha sido una gran fuerza impulsora para el estudio en el reciente campo de la biociencia. El método de PCR permite la amplificación exponencial de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un ácido nucleico molde usando una pequeña cantidad del molde. El método de PCR prevalece ampliamente en la actualidad como herramienta para clonar o detectar un gen. En el método de PCR, un par de cebadores, que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria, se usa para ambos extremos de la secuencia de nucleótidos diana. El par de cebadores está diseñado de tal manera que un cebador se híbrida con un producto de extensión proporcionado por otro cebador. Una reacción de síntesis avanza repitiendo una hibridación con el producto de extensión mutuo y una reacción de síntesis de hebra complementaria, y se obtiene por tanto una amplificación exponencial.

En el método de PCR, un molde de ácido nucleico monocatenario se prepara mediante algún método y un cebador se híbrida con el molde. Puesto que una ADN polimerasa dependiente de molde requiere un cebador como origen de replicación, se considera que es esencial la preparación del molde monocatenario, para hibridar el cebador con el mismo en el método de PCR. La etapa de conversión de un ácido nucleico molde bicatenario en una hebra individual se denomina generalmente desnaturalización. La desnaturalización se lleva a cabo habitualmente mediante calentamiento. Puesto que otros componentes de reacción requeridos para la síntesis de ácido nucleico, incluyendo ADN polimerasa, son resistentes al calor, la desnaturalización y las sucesivas reacciones de síntesis de hebra complementaria pueden llevarse a cabo combinando todos los componentes de reacción y calentando adicionalmente la mezcla de reacción. Sin embargo, los métodos convencionales que contienen la etapa de tratamiento térmico tienen los problemas descritos a continuación.

En primer lugar, en el método de PCR, la desnaturalización de ácido nucleico bicatenario y la hibridación de un cebador deben realizarse en cada ciclo. Con ese fin, se requiere un mecanismo específico para controlar la temperatura. Por ejemplo, aunque se ha desarrollado un método para monitorizar el aumento de un producto de reacción durante la PCR, el método no puede llevarse a cabo usando equipo analítico convencional y, por tanto, es necesario proporcionar equipo dedicado que tiene un mecanismo para controlar la temperatura para llevar a cabo el método de PCR así como un mecanismo para monitorizar la reacción. Por consiguiente, si todas las reacciones para la síntesis de ácido nucleico pudieran llevarse a cabo a temperatura constante, la reacción podría monitorizarse fácilmente usando equipo analítico convencional. Un método conveniente de este tipo simplificaría no sólo el equipo sino también el funcionamiento experimental. Sin embargo, no se conoce actualmente un principio de reacción para este método.

La especificidad de reacción de la PCR depende de la especificidad de hibridación de cebadores. Puede esperarse que un cebador se hibride con un ácido nucleico monocatenario con especificidad adecuada a alta temperatura, próxima a la temperatura de fusión. Cuando la temperatura no es adecuadamente alta, se produce a menudo una hibridación no específica y reacciones de síntesis de hebra complementaria no específicas resultantes. Puesto que el método de PCR va acompañado por un cambio de temperatura complicado, la mezcla de reacción puede verse expuesta posiblemente a una temperatura a la que tiene tendencia a producirse una reacción no específica. Esta es una de las causas de las reacciones no específicas asociadas con el método de PCR.

Se han propuesto varios métodos para resolver el problema de la reacción no específica dependiente de la temperatura. Por ejemplo, un método usado en la práctica usa una ADN polimerasa que no funciona a una determinada temperatura o inferior. Específicamente, se notifica que se usan un inhibidor de ADN polimerasa sensible a la temperatura, un anticuerpo contra la ADN polimerasa, o una vahante de ADN polimerasa y similares. Además, también se conoce un método en el que los componentes de reacción se ponen en compartimentos separados por un tabique que puede fundirse a alta temperatura, de modo que los componentes se mezclan sólo tras calentarse hasta una temperatura adecuada. En todos los casos, puesto que el método de PCR acompaña un cambio de temperatura complicado, se requiere usar un componente especial para Impedir la reacción no específica.

También se conocen métodos de amplificación de ADN que tiene una secuencia complementarla a una secuencia diana usando la secuencia diana como molde, tal como el método de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), (Pro.N.A.S., 89, págs. 392-396; 1992, Nuclelc Acid, Res., 2, págs. 1691-1696; 1992). En el método SDA, cuando se sintetiza una hebra complementaria usando como origen de síntesis un cebador complementarlo al lado 3 de una determinada secuencia de nucleótidos, una ADN polimerasa única permite la síntesis de una hebra complementaria que desplaza la región de doble hebra en el lado 5. Cuando se citan el "lado 5" o el "lado 3" a

continuación en el presente documento, los términos significan el sentido de una hebra molde. Este método se denomina amplificación por desplazamiento de hebra porque la parte de doble hebra del lado 5 se desplaza por una hebra complementarla que acaba de sintetizarse.

En el método SDA, la etapa de cambio de temperatura, que es esencial para el método de PCR, puede omitirse Insertando una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en una secuencia con la que se híbrida un cebador. Concretamente, una mella proporcionada por la enzima de restricción proporciona un grupo 3-OH que se convierte en el origen de la síntesis de hebra complementaria. El desplazamiento de hebra y la síntesis de hebra complementaria se llevan a cabo desde el origen y la hebra complementaria sintetizada se disocia como una hebra individual y se utiliza como el molde en la síntesis de hebra complementaria posterior. Por tanto, el método SDA no requiere un control de temperatura complicado que ha sido esencial para el método de PCR.

Aunque el control de temperatura no es necesario en el método SDA, el tratamiento térmico es todavía necesario para preparar la hebra individual necesaria para la hibridación de cebadores cuando se usa ácido nucleico bicatenario como molde. Además, este método requiere tanto una enzima de restricción que proporciona una mella como una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra. La necesidad de una enzima adicional conduce a un aumento en el coste. Además, para introducir una mella y no escindir la doble hebra (es decir, sólo se escinde una hebra), debe usarse un derivado de dNTP, tal como a-tiodNTP, como sustrato para la síntesis de modo que una de las dobles hebras tenga resistencia a la digestión enzimática. Por consiguiente, un producto amplificado obtenido mediante SDA tiene una configuración diferente de la del ácido nucleico natural. Por tanto, la escisión con enzimas de restricción y el uso de un producto amplificado en clonación génica son limitados. El uso del derivado de dNTP también provoca un aumento en el coste.

Como método para amplificar ácido nucleico sin un control de temperatura complicado, se conoce la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), que también se denomina método de amplificación mediada por transcripción, TMA. NASBA es un sistema de reacción en el que se lleva a cabo síntesis de ADN usando ADN polimerasa, un ARN diana como molde, y una sonda a la que se le ha añadido el promotor de T7. El ADN sintetizado se hace bicatenario usando una segunda sonda, y se realiza la transcripción usando ARN polimerasa de T7. El ADN bicatenario obtenido se usa como molde, amplificando de ese modo una gran cantidad de ARN (Nature, 35, págs. 91-92, 1991). La transcripción usando ARN polimerasa de T7 en NASBA avanza de manera isotérmica. Sin embargo, NASBA requiere ARN como molde, y por tanto no puede aplicarse a ácido nucleico bicatenario. Si el ácido nucleico bicatenario se hace monocatenario, esta reacción puede realizarse; sin... [Seguir leyendo]

Método para amplificar y detectar una secuencia de nucleótidos diana en una muestra, comprendiendo el método llevar a cabo un método de amplificación y observar si se ha generado o no el producto de la reacción de amplificación,

en el que el método de amplificación es un método para la amplificación de ácido nucleico a temperatura constante usando ácido nucleico bicatenario como molde, en el que una hebra del ácido nucleico bicatenario comprende regiones F3c, F2c, F1c, R1, R2 y R3 del lado 3 del ácido nucleico bicatenario y en el que la otra hebra del ácido nucleico bicatenario comprende las regiones complementarias F3, F2, F1, R1c, R2c y R3c del lado 5 del ácido nucleico bicatenario, en el que el método comprende:

a) incubar un molde de ácido nucleico bicatenario y un cebador interno RA constituido por regiones R1c y R2, mediante lo cual la región R2 se híbrida con la región R2c en el molde de ácido nucleico bicatenario en presencia de una ADN polimerasa que cataliza una reacción de síntesis de hebra complementaria que acompaña a un desplazamiento de hebra, en condiciones en las que el ácido nucleico bicatenario es inestable usando el cebador interno RA como origen, de tal manera que una región F2c del ácido nucleico molde diana que va a hibridarse por un cebador interno FA constituido por regiones F1c y F2, mediante lo cual la región F2 se híbrida con la región F2c en el molde de ácido nucleico bicatenario que puede amplificar el ácido nucleico molde a temperatura constante cuando la hebra individual liberada se híbrida de manera intramolecular con sí mismo

b) hibridar un cebador externo F3 con la región F3c de la hebra individual desplazada en la etapa a), que se coloca en condiciones tales que puede experimentar apareamiento de bases;

c) llevar a cabo la síntesis de hebra complementaria usando el cebador externo F3 como origen de síntesis, mediante lo cual el producto extendido sintetizado usando el cebador interno FA como origen se desplaza y se libera como una hebra individual; y

d) usar la hebra individual como molde, el cebador interno RA y el cebador externo R3, mediante lo cual la región R2 se híbrida con la región R2c, y R3 se híbrida con la región R3c en la hebra individual desplazada en la etapa c) e iniciar la síntesis de hebra complementaria.

Método para detectar una mutación mediante el método de detección según la reivindicación 1, en el que una mutación en una secuencia de nucleótidos que va a amplificarse impide la síntesis de hebra complementaria, al menos en un extremo 3 que es el origen de la síntesis de hebra complementaria que constituye el método de amplificación.