MÉTODO PARA IDENTIFICAR Y PURIFICAR CÉLULAS T REGULADORAS NATURALES HUMANAS (NTREG).
Método para identificar y purificar células T reguladoras naturales humnas (nTret).
Método para aislar o purificar células nTreg de una muestra biológica, preferiblemente de un sujeto con una enfermedad inflamatoria o autoinmune. Además la invención también se refiere a un kit para aislar o purificar células nTreg de una muestra biológica.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030096.
Solicitante: UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: NOGUEIRA ALVAREZ,MONTSERRAT, SALGADO CASTRO,FCO. JAVIER, ARIAS CRESPO,PILAR, PÉREZ DÍAZ,AMPARO, MARTÍNEZ VILLANUEVA,NORA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K16/28 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
- C12N5/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
- C12N5/07 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos animales.
- C12N5/0783 C12N 5/00 […] › Células T; Células NK; Progenitores de células T o NK.
PDF original: ES-2363545_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Método para identificar y purificar células T reguladoras naturales humanas (nTreg).
La presente invención se encuadra en el campo de la inmunología. Concretamente, la invención se refiere a un método y un kit para aislar o purificar células nTreg de una muestra biológica, preferiblemente de un sujeto con una enfermedad inflamatoria o autoinmune.
Estado de la técnica anterior
Las células T reguladoras naturales CD4+CD25+, también llamadas células nTreg, suponen el 5-10% de los linfocitos T CD4+ de sangre periférica. Su función es inhibir la activación y las funciones efectoras (proliferación, producción de citoquinas y anticuerpos, etc) de otras células del sistema inmunológico, las llamadas células "efectoras", que son las que llevan a cabo la respuesta inmunológica (por ejemplo, otros linfocitos T, pero también linfocitos B, células NK y NKT, células presentadoras de antígenos, etc).
Inicialmente se pensaba que las células nTreg controlaban exclusivamente las respuestas a los antígenos propios (autoantígenos) por parte de las células efectoras, y que por eso la eliminación de esta subpoblación especializada de linfocitos generaba el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas. Sin embargo, pronto se supo que también suprimían respuestas a antígenos ajenos (aloantígenos) o tumorales, controlando de este modo el desencadenamiento de respuestas inmunológicas excesivas (en el caso de infecciones víricas o bacterianas, por ejemplo) o impidiendo la generación de respuestas inmunológicas (como, por ejemplo, en el caso del cáncer o el sida).
Existe, por tanto, un interés creciente en investigar el papel de las células nTreg en el contexto de ciertas enfermedades (infecciones, enfermedades autoinmunes, cáncer o sida) así como en transplantes. En este sentido, las células nTreg podrían ser empleadas en terapias inmunológicas; por ejemplo haciendo uso de su actividad supresora en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias o en transplantes, o bien suprimiendo dicha función en el tratamiento del cáncer o el sida. Así, las células nTreg podrían ser aisladas de muestras procedentes de pacientes con distintas enfermedades (artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple, sida, linfoma agudo de células T) para estudiar su funcionalidad, conocer su número y proporción con respecto a otros linfocitos, etc, o bien de manera aún más aplicada en terapias inmunológicas personalizadas: por ejemplo, purificando de la sangre del paciente las células nTreg, expandiendo esa población de linfocitos in vitro, y reintroduciéndolas nuevamente en el mismo individuo con el fin de controlar una enfermedad autoinmune o evitar que el rechazo de un órgano transplantado, por ejemplo.
Para la identificación y purificación de las células nTreg es imprescindible su caracterización fenotípica mediante marcadores moleculares que pueden estar bien presentes o ausentes, o al menos en mayor o menor medida, en estos linfocitos en comparación con las células T efectoras. Dichos marcadores moleculares permiten delimitar, dentro de los linfocitos T CD4+, cuáles son células nTreg y cuáles "efectores", y así visualizarlos, contabilizarlos o evaluar su presencia en distintos tejidos mediante citometría o microscopía por ejemplo, o bien purificarlos mediante FACS o medios magnéticos para un uso posterior, como por ejemplo en transplantes autólogos clínicos.
Las células nTreg humanas expresan de forma constitutiva en su superficie proteínas como CD4, CD25/IL-2Rα, CD27, LAG-3, galectina-1, CD38, neuropilina/RNP, OX-40L, CD5, TNFR2, TGFβR1, GPR83, CD45RO, CTLA-4, HLA-DR o GITR. Este gran número de marcadores genera una falsa sensación de certeza a la hora de delimitar y diferenciar plenamente la población de células nTreg de los linfocitos T "efectores". Sin embargo, los marcadores descritos hasta la fecha presentan varios problemas. En primer lugar, debido a la heterogeneidad existente en la población de células nTreg, estos marcadores no están presentes en el 100% de las células nTreg. En segundo lugar, estos marcadores no son exclusivos de este linaje celular. Así, pueden estar ausentes en células T "efectoras" en reposo, pero expresarse en células "efectoras" activadas o de memoria; o por el contrario, pueden ser expresados por células T "efectoras" en reposo, pero perder dicha expresión cuando se convierten en células activadas o de memoria.
La mayoría de las células nTreg expresan constitutiva y fuertemente CD25 y esta expresión no se pierde con la activación de las células nTreg. En cambio, las células T "efectoras", inicialmente CD4+CD25- cuando están en reposo (una característica que precisamente permite distinguirlas de las células nTreg CD4+CD25+) aumentan la expresión de CD25 cuando se activan (Baecher-Allan C. et al. J. Immunol. 2001, 167: 1245). El mismo problema sucede con GITR (McHugh R.S. et al. Immunity 2002, 16: 311), HLA-DR (Salgado F.J. et al. Immunol. Cell. Biol. 2002, 80: 138) o CTLA-4/CD152 (Perkins D. et al. J. Immunol. 1996, 156: 4154), por ejemplo.
La nula o baja presencia de CD127 en la superficie celular ha sido vinculada a la existencia de un fenotipo nTreg en los linfocitos de donantes sanos (Liu W. et al. J. Exp. Med. 2006, 203: 1701; Seddiki N. J. Exp. Med. 2006, 203: 1693; Banham A.H. TRENDS Immunol 2006, 27: 541; WO 2007140472; WO 2007140472). Sin embargo, la existencia de inflamación, por ejemplo, en pacientes con artritis reumatoide) (Aerts N.E. et al. Cell. Immunol. 2008, 251: 109), hace aparecer células T CD4+CD25+CD127- que no son células nTreg, sino células T efectoras activadas.
FoxP3 representa un marcador más ligado a un fenotipo de célula reguladora, y su detección en células permeabilizadas mediante anticuerpos monoclonales anti-FoxP3 es empleada por muchos investigadores para la identificación de estas células in vivo. Sin embargo, el hecho de que FoxP3 sea un marcador intracelular hace que no pueda ser empleado en protocolos de purificación de células nTreg sin "matar" previamente a los linfocitos que queremos "etiquetar" debido a la necesidad de permeabilizar las células. Pero además, este marcador no es absolutamente específico de células nTreg, ya que trabajos bastante recientes indican que, al menos en humanos, la activación de células T "efectoras" CD4+CD25- induce una expresión transitoria de FoxP3 (Tran D.Q. et al. Blood 2007, 110: 2983; Ziegler S.F. et al. Eur. J. Immunol 2007, 37: 21; Roncarolo M.-G y Gregori S. Eur. J. Immunol. 2008, 38: 901).
CD49d (cadena α de la integrina VLA-4) se expresa en la mayoría de las células efectoras pro-inflamatorias productoras de IFNγ o IL-17, pero no en las nTreg (Kleinewietfeld M et al. Blood 2009, 113: 827; WO2009047003). Sin embargo, aunque se ha demostrado que el fenotipo CD4+CD25+CD49d- permite identificar a las células nTreg cuando la población de linfocitos procede de un individuo sano, no se ha comprobado si CD49d permitiría caracterizar o purificar las células nTreg en el caso de linfocitos procedentes de pacientes con enfermedades inflamatorias o cáncer.
Recientemente, se ha propuesto la utilización de CD39 como marcador de nTreg humanas. Empleando linfocitos procedentes de pacientes con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, se ha demostrado su eficacia en la identificación de nTregs en un contexto de activación celular o situación inflamatoria. Sin embargo, aunque las células CD4+CD39+ expresan bajos niveles de CD127, éstas sólo contienen un 50-70% de células FoxP3+ en individuos sanos, o un 50-90% de células FoxP3+ en pacientes con carcinoma. (Mandapathil et al. J. Immunol. Methods 2009, 346: 55). De esta manera, dentro de los linfocitos CD4+CD39+ existen células que expresan nulos o bajos niveles de FoxP3 y que pueden ser linfocitos T efectores.
Por tanto, la falta de especificidad de la que adolecen los marcadores de descritos hasta la fecha, complica la identificación y purificación de células nTreg, especialmente en aquellas muestras procedentes de individuos con enfermedades inflamatorias. En la mayoría de los protocolos (Miltenyi Biotech, BD Biosciences, Invitrogen) la purificación de células nTreg mediante sistemas magnéticos se basa en los marcadores CD4 y CD25, y se hace mediante dos pasos. El primero de ellos es un proceso de selección negativa en el que se eliminan las células T que no son CD4+ (eritrocitos, plaquetas, linfocitos T CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, células NK, macrófagos, células dendríticas,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Método para aislar células T reguladoras naturales (nTreg) de una muestra biológica aislada, que comprende las siguientes etapas:
2. Método según la reivindicación 1, donde en la etapa (a) la muestra biológica se trata además con un anticuerpo anti-CD127 y/o con un anticuerpo anti-CD49d.
3. Método según la reivindicación 1, donde en la etapa (b) se lleva a cabo la eliminación de las células CD25- y CD26+ de la muestra biológica.
4. Método según la reivindicación 2, donde en la etapa (b) se lleva a cabo la eliminación de las células:
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde en la etapa (b) se eliminan de la muestra biológica las células que no son T CD4+.
6. Método según la reivindicación 5, donde en la etapa (a) además se trata la muestra biológica con un anticuerpo anti-CD4. la muestra biológica con un anticuerpo anti-CD4.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde en la etapa (a) además se trata la muestra biológica con al menos un anticuerpo que reconoce una molécula presente en células que no son T CD4+.
8. Método según la reivindicación 7, donde en la etapa (a) se trata la muestra biológica con al menos un anticuerpo que reconoce una molécula presente en células que no son T CD4+ seleccionado de la lista que comprende: anticuerpo anti-CDδ, anticuerpo anti-CD11b/Mac1, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD16, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD36, anticuerpo anti-CD41a, anticuerpo anti-CD56, anticuerpo anti-CD123, anticuerpo anti-CD235a y anticuerpo anti-γδTCR, o cualquiera de sus combinaciones.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde en la etapa (a) se trata la muestra biológica con al menos un anticuerpo anti-CD45RO o un anticuerpo anti-CD45RA.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde al menos uno de los anticuerpos empleados en la etapa (a) está marcado.
11. Método según la reivindicación 10, donde al menos uno de los anticuerpos empleados en la etapa (a) está marcado con una etiqueta seleccionada de la lista que comprende: un radioisótopo, un marcador fluorescente o luminiscente, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una etiqueta de afinidad, una enzima y un substrato de una enzima.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde al menos uno de los anticuerpos empleados en la etapa (a) está inmovilizado.
13. Método según la reivindicación 12, donde al menos uno de los anticuerpos empleados en la etapa (a) está inmovilizado en un soporte seleccionado de la lista que comprende: una matriz de nylon, en un soporte de plástico o en cuentas.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la etapa (b) se lleva a cabo mediante al menos un método seleccionado de la lista que comprende: centrifugación, fluorescence activated cell sorting/FACS, cell elutriation, separación magnética celular, separación inmunológica basada en columna, adhesión celular, tisis mediante complemento o citometría de flujo, o cualquiera de sus combinaciones.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende: bazo, timo, ganglio linfático, médula ósea, placa de Peyer, amígdala, fluido sinovial, linfa, líquido cefalorraquídeo, orina, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido amniótico, exudado, sangre, concentrado leucocitario, células mononucleares de sangre periférica, linfocitos de sangre periférica o líneas celulares.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde la muestra biológica proviene de un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa o una enfermedad parasitaria.
17. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que comprende un anticuerpo anti-CD25 y un anticuerpo anti-CD26.
18. Kit según la reivindicación 17, que además comprende un anticuerpo anti-CD127, y/o un anticuerpo anti-CD49d.
19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, que además comprende un anticuerpo anti-CD4.
20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que además comprende al menos un anticuerpo que reconoce una molécula presente en células que no son T CD4+.
21. Kit según la reivindicación 20, donde el anticuerpo que reconoce una molécula presente en células que no son T CD4+ se selecciona de la lista que comprende: anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD11b/Mac1, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD16, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD36, anticuerpo anti-CD41a, anticuerpo anti-CD56, anticuerpo anti-CD123, anticuerpo anti-CD235a o anticuerpo anti-γδTCR.
22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, que además comprende un anticuerpo anti-CD45RO y/o un anticuerpo anti-CD45RA.
23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, donde al menos uno de dichos anticuerpos está marcado.
24. Kit según la reivindicación 23, donde al menos uno de los anticuerpos está marcado con una etiqueta seleccionada de la lista que comprende: un radioisótopo, un marcador fluorescente o luminiscente, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una etiqueta de afinidad, una enzima y un substrato de una enzima.
25. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, donde al menos uno de los anticuerpos está inmovilizado.
26. Kit según la reivindicación 25, donde al menos uno de los anticuerpos está inmovilizado en un soporte seleccionado de la lista que comprende: una matriz de nylon, un soporte de plástico o cuentas.
27. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, que además comprende al menos un elemento necesario para la separación de células mediante un método seleccionado de la lista que comprende: centrifugación, separación celular activada por fluorescencia/FACS, separación magnética celular, separación inmunológica basada en columna, adhesión celular o lisis mediante complemento.
28. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, que además comprende al menos un elemento seleccionado de la lista que comprende: columnas, soportes de columnas, tubos de recolección de fracciones, imanes, tamices para eliminar los agregados celulares, soluciones que contengan factores de complemento, soluciones isotónicas de lavado, soluciones de separación/enriquecimiento celular, cuentas superparamagnéticas, placas o soportes de plástico con anticuerpos u otras moléculas unidas, componentes que permitan la eliminación de las células muertas antes del proceso de purificación, soluciones para la exclusión de las células muertas durante la evaluación por citometría de flujo de la pureza de las nTregs una vez aisladas, anticuerpos unidos a fluorocromos para evaluar por citometría de flujo la pureza de las nTreg una vez purificadas o soluciones de permeabilización celular para evaluar por citometría de flujo la pureza de las nTreg una vez purificadas.
29. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28 para aislar células nTreg de una muestra biológica aislada.
30. Uso del kit según la reivindicación 29, donde la muestra biológica proviene de un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa o una enfermedad parasitaria.
31. Método para identificar células nTreg en una muestra biológica aislada, que comprende las siguientes etapas:
32. Método para identificar células nTreg en una muestra biológica aislada según la reivindicación 31, donde en la muestra biológica de la etapa (a) además se detecta el producto de expresión del gen FoxP3, CD127 o CD49d, o cualquiera de sus combinaciones y en la etapa (c) se asigna la comparación realizada en la etapa (b) a la identificación de las células nTreg, cuando además,
cualquiera de sus combinaciones.
33. Método según la reivindicación 32, donde en la etapa (a) se detecta la expresión de los genes CD25, CD26 y FoxP3, y en la etapa (c) se asigna la comparación realizada en la etapa (b) a la identificación de las células nTreg cuando se detectan las cantidades de producto definidas para CD25, CD26 y FoxP3.
34. Método según la reivindicación 32, donde en la etapa (a) se detecta la expresión de los genes CD25 y CD26 y además CD127 y/o CD49d, y en la etapa (c) se asigna la comparación realizada en la etapa (b) a la identificación de las células nTreg cuando se detectan las cantidades de producto definidas para CD25 y CD26 y además para CD127 y/o CD49d.
35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34 donde en la etapa (a) además se detecta la cantidad del producto de la expresión del gen CD4, y en la etapa (c) se asigna la comparación realizada en la etapa (b) a la identificación de las células nTreg, cuando además la cantidad del producto de expresión del gen CD4 detectada es significativamente mayor que la cantidad de referencia para el gen CD4.
36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 donde en la etapa (a) además se detecta la cantidad del producto de la expresión de al menos uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: TCRαβ, CD3, CD5, CD11a/LFA-1, CD27, CD28, CD30, CD31, CD38, CD39, CD44, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD45RC, CD54/ICAM-1, CD57, CD58, CD62UL-selectina, CD62P/P-selectina, CD71, CD73, CD83, CD80, CD86, CD95/Fas/APO-1, CD101, CD103, CD122/IL-2Rβ, CD132, CD134/OX-40, CD137/4-1 BB, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD223/LAG-3, PD-1, PD-L1, GITR, IL-10, TGFβ, galectina-1, Neuropilina/NRP, Neopterina, TNFR2, TGFβR1, G-protein-coupled receptor 83/GPR83, HLA-DR, ICOS, GARP, FR4, TLR4, TLR5, TLR8, CRTH2, CCR7, CCR4, CCR8, CCR5, CXCR4, CXCR5, CLA, granzima A o granzima B.
37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, donde el producto de la expresión de los genes detectada en la etapa (a) es el ARNm.
38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 37, donde el producto de la expresión de los genes detectada en la etapa (a) es la proteína.
39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende: bazo, timo, ganglio linfático, médula ósea, placa de Peyer, amígdala, fluido sinovial, linfa, líquido cefalorraquídeo, orina, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido amniótico, exudado, sangre, concentrado leucocitario, células mononucleares de sangre periférica, linfocitos de sangre periférica o líneas celulares.
40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 39 donde la muestra biológica proviene de un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa o una enfermedad parasitaria.
41. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 40 que comprende los elementos necesarios para detectar en una muestra biológica el producto de la expresión del gen CD25 y del gen CD26, donde dichos elementos se seleccionan de entre:
42. Kit según la reivindicación 41, que además comprende los elementos necesarios para detectar en una muestra biológica el producto de la expresión de al menos uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: FoxP3, CD127 o CD49d, o cualquiera de sus combinaciones, donde dichos elementos se seleccionan de entre una sonda, un cebador o un anticuerpo que permite detectar, respectivamente, el producto de expresión de al menos un gen seleccionado de la lista que comprende: FoxP3, CD127 o CD49d, o cualquiera de las combinaciones de dichos elementos.
43. Kit según la reivindicación 42, que comprende los elementos necesarios para detectar en una muestra biológica el producto de la expresión de los genes CD25, CD26 y FoxP3, donde dichos elementos se seleccionan de entre una sonda, un cebador o un anticuerpo que permite detectar, respectivamente, el producto de expresión de los genes CD25, CD26 y FoxP3, o cualquiera de las combinaciones de dichos elementos.
44. Kit según la reivindicación 42, que comprende los elementos necesarios para detectar en una muestra biológica el producto de la expresión de los genes CD25 y CD26, y además, de los genes CD127 y/o CD49d, donde dichos elementos se seleccionan de entre una sonda, un cebador o un anticuerpo que permite detectar, respectivamente, el producto de expresión de los genes CD25 y CD26, y además, de los genes CD127 y/o CD49d, o cualquiera de las combinaciones de dichos elementos.
45. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44 que además comprende una sonda, un cebador o un anticuerpo que permite detectar el producto de expresión del gen CD4.
46. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45 que además comprende una sonda, un cebador o un anticuerpo que permite detectar el producto de expresión de al menos un gen seleccionado de la lista que comprende: TCRβ, CD3, CD5, CD11a/LFA-1, CD27, CD28, CD30, CD31, CD38, CD39, CD44, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD45RC, CD54/ICAM-1, CD57, CD58, CD62L/L-selectina, CD62P/P-selectina, CD71, CD73, CD83, CD80, CD86, CD95/Fas/APO-1, CD101, CD103, CD122/IL-2Rβ, CD132, CD134/OX-40, CD137/4-1BB, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD223/LAG-3, PD-1, PD-L1, GITR, IL-10, TGFβ, galectina-1, Neuropilina/NRP, Neopterina, TNFR2, TGFβR1, G-protein-coupled receptor 83/GPR83, HLA-DR, ICOS, GARP, FR4, TLR4, TLR5, TLR8, CRTH2, CCR7, CCR4, CCR8, CCR5, CXCR4, CXCR5, CLA, granzima A o granzima B.
47. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46, donde al menos uno de los anticuerpos está marcado.
48. Kit según la reivindicación 47, donde al menos uno de los anticuerpos está marcado con una etiqueta seleccionada de la lista que comprende: un radioisótopo, un marcador fluorescente o luminiscente, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una etiqueta de afinidad, una enzima o un substrato de una enzima.
49. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48, donde al menos uno de los anticuerpos está inmovilizado.
50. Kit según la reivindicación 49, donde al menos uno de los anticuerpos está inmovilizado en un soporte seleccionado de la lista que comprende: una matriz de nylon, un soporte de plástico o cuentas.
51. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 50, que además comprende al menos un elemento seleccionado de la lista que comprende controles positivos y/o negativos, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, polimerasas, nucleótidos, soportes, recipientes o instrucciones.
52. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 51 para identificar células nTreg de una muestra biológica aislada.
53. Uso del kit según la reivindicación 52, donde la muestra biológica proviene de un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad alérgica, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa o una enfermedad parasitaria.
54. Método para purificar células nTreg que comprende:
55. Método según la reivindicación 54, que además en la etapa (a) comprende tratar la población de células con anticuerpo anti-CD127 y/o con un anticuerpo anti-CD49d, y en el apartado (b) se seleccionan las células CD127- y/ o CD49d-.
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