Método de clasificación óptica.

Un método para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividaddeseada,

cuya expresión puede dar como resultado, directa o indirectamente, la modificación de una propiedadóptica de un elemento genético que codifica el producto génico, que comprende las etapas de:

(a) expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos, de forma que losproductos génicos están conectados con los genes que los codifican;

(b) compartimentar los productos génicos en microcápsulas;

(c) modificar el elemento genético dentro de la microcápsula, utilizando la actividad del producto génicopara permitir el aislamiento del elemento genético;

(d) romper las microcápsulas y reunir los contenidos de las microcápsulas que comprenden los elementosgenéticos; y

(e) clasificar los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que tienen la actividaddeseada según un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.

Método de clasificación óptica

La presente invención se refiere a métodos para utilizar en la evolución in vitro de bancos moleculares. En particular, la presente invención se refiere a métodos para seleccionar ácidos nucleicos que codifican productos génicos, en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están conectados mediante compartimentación.

La evolución necesita que se genere diversidad genética (diversidad en los ácidos nucleicos) , seguida de la selección de los ácidos nucleicos que producen características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado en un organismo están físicamente conectados (los ácidos nucleicos están confinados dentro de las células para las que codifican) , múltiples rondas de mutación y selección pueden dar como resultado la progresiva supervivencia de los organismos con aptitud cada vez mayor. Los sistemas para la evolución rápida de ácidos nucleicos o proteínas in vitro imitan de forma ventajosa este proceso a nivel molecular, puesto que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están conectados y la actividad del producto génico es seleccionable.

Recientes avances en biología molecular han permitido coseleccionar algunas moléculas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados después pueden clonarse para un posterior análisis o uso, o someterse a más rondas de mutación y selección.

Un aspecto común a estos métodos es el establecimiento de grandes bancos de ácidos nucleicos. Las moléculas que tengan las características deseadas (actividad) pueden aislarse mediante regímenes de selección que seleccionen la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo actividad de unión.

La tecnología de presentación de fagos ha tenido un gran éxito en proporcionar un vehículo que permite la selección de una proteína presentada proporcionando la conexión fundamental entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1993; para un análisis, véase Clackson y Wells, 1994) . Las partículas de fagos filamentosos actúan como paquetes de presentación genética con proteínas sobre la parte exterior y, en el interior, los elementos genéticos que las codifican. La estrecha conexión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado es el resultado del ensamblaje del fago dentro de la bacteria. Puesto que las bacterias individuales raramente sufren una infección múltiple, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos por una bacteria individual portarán el mismo elemento genético y presentarán la misma proteína.

Sin embargo, la presentación de fagos se basa en la creación de bancos de ácidos nucleicos in vivo en bacterias. Por tanto, la limitación práctica del tamaño del banco en la tecnología de la presentación de fagos es del orden de 107 a 1011, incluso aprovechando los vectores de fagos I con replicones de fagos filamentosos escindibles. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección de moléculas con actividad de unión. Un pequeño número de proteínas con actividad catalítica también se ha aislado utilizando esta técnica, pero la selección no se realizó directamente para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un análogo del estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o para la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997) . En fechas más recientes, ha habido algunos ejemplos de enzimas seleccionadas utilizando la presentación de fagos mediante la formación del producto (Atwell y Wells, 1999; Demartis et al., 1999; Jestin et al., 1999; Pederson et al., 1998) , pero en todos estos casos la selección no fue para el recambio múltiple.

Se han seleccionado ligandos peptídicos específicos para la unión a receptores mediante selección de afinidad utilizando grandes bancos de péptidos conectados al extremo C-terminal del represor de lac LacI (Cull et al., 1992) . Cuando se expresa en E. coli, la proteína represora conecta físicamente el ligando con el plásmido codificante mediante la unión a una secuencia del operador lac sobre el plásmido.

También se ha indicado un sistema de presentación de polisomas completamente in vitro (Mattheakis et al., 1994; Hanes y Pluckthun, 1997) , en el que péptidos nacientes se unen físicamente a través del ribosoma al ARN que los codifica. Como alternativa, también se ha descrito un sistema completamente in vitro para conectar el genotipo al fenotipo mediante fusiones de ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997; Nemoto et al., 1997) .

Sin embargo, el alcance de los anteriores sistemas se limita a la selección de proteínas y, además, no permite la selección directa de actividades distintas de la unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.

La selección y evolución de ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990) , denominada a veces SELEX (“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment”, evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la selección de la actividad de unión y química, pero sólo para ácidos nucleicos. Cuando la selección es para la unión, una agrupación de ácidos nucleicos se incuba con un sustrato inmovilizado. Los no ligantes se retiran por lavado, después los ligantes se liberan, se amplifican, y el proceso completo se repite en etapas iterativas para enriquecer en secuencias que se unen mejor. Este método también puede adaptarse para permitir el aislamiento de ADN y ARN catalítico (Green y Szostak, 1992; para un análisis, véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995) .

Sin embargo, la selección para la actividad “catalítica” o de unión utilizando SELEX sólo es posible porque la misma molécula desempeña el papel dual de portar la información genética y ser el catalizador o la molécula de unión (aptámero) . Cuando la selección es para la “autocatálisis”, la misma molécula también debe desempeñar el tercer papel de ser un sustrato. Puesto que el elemento genético debe desempeñar el papel de sustrato y catalizador, la selección sólo es posible para acontecimientos de un solo recambio. Debido a que, en este proceso, el propio “catalizador” es modificado, por definición no es un verdadero catalizador. Además, es posible que las proteínas no puedan seleccionarse utilizando el procedimiento SELEX. La gama de catalizadores, sustratos y reacciones que pueden seleccionarse, por tanto, está gravemente limitado.

De los anteriores métodos, aquellos que permiten rondas iterativas de mutación y selección imitan los mecanismos in vitro que normalmente se atribuyen al proceso de la evolución: variación iterativa, selección progresiva de una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de estos métodos desarrollados hasta la fecha ha proporcionado moléculas de diversidad y eficacia funcional comparables a las que se encuentran en la naturaleza. Además, no existen sistemas de “evolución” fabricados por seres humanos que puedan hacer evolucionar ácidos nucleicos y proteínas para lograr la gama completa de actividades bioquímicas y biológicas (por ejemplo, actividades de unión, catalíticas y reguladoras) , y que puedan combinar varios procesos que conduzcan a un producto o actividad deseados.

Por tanto, es muy necesario un sistema in vitro que supere las limitaciones analizadas anteriormente.

En Tawfik y Griffiths (1998) , y en la solicitud de patente internacional WO 9902671, se describe un sistema para la evolución in vitro que supera muchas de las limitaciones descritas anteriormente utilizando la compartimentación en microcápsulas para conectar el genotipo y el fenotipo a nivel molecular.

En Tawfik y Griffiths (1998) , y en varias realizaciones de la solicitud de patente internacional WO 9902671, la actividad deseada de un producto génico produce la modificación del elemento genético que lo codifica (y que está presente en la misma microcápsula) . El elemento genético modificado entonces puede seleccionarse en una etapa posterior.

En la presente se describe otra invención en la que la modificación del elemento genético provoca un cambio en las propiedades ópticas del propio elemento,... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividad deseada, cuya expresión puede dar como resultado, directa o indirectamente, la modificación de una propiedad óptica de un elemento genético que codifica el producto génico, que comprende las etapas de:

(a) expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos, de forma que los productos génicos están conectados con los genes que los codifican;

(b) compartimentar los productos génicos en microcápsulas;

(c) modificar el elemento genético dentro de la microcápsula, utilizando la actividad del producto génico para permitir el aislamiento del elemento genético;

(d) romper las microcápsulas y reunir los contenidos de las microcápsulas que comprenden los elementos genéticos; y

(e) clasificar los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que tienen la actividad deseada según un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la modificación del elemento genético dentro de la microcápsula induce un cambio en sus propiedades ópticas.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que la modificación del elemento genético permite que sea posteriormente modificado fuera de la microcápsula para inducir un cambio en sus propiedades ópticas.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que una parte del elemento genético es un ligando, y el producto génico deseado dentro de la microcápsula se une, directa o indirectamente, a dicho ligando para permitir el aislamiento del elemento genético.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que el ligando también es codificado por el elemento genético.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que una parte del elemento genético es un sustrato, y la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula da como resultado, directa o indirectamente, la conversión de dicho sustrato en un producto que sigue siendo parte del elemento genético y permite su aislamiento.

7. Un método según la reivindicación 1, en el que el producto de la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula da como resultado, directa o indirectamente, la generación de un producto que posteriormente forma un complejo con el elemento genético y permite su aislamiento.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula da como resultado, directa o indirectamente, la alteración de la expresión de un segundo gen dentro de la microcápsula, y la actividad del producto de dicho segundo gen permite el aislamiento del elemento genético utilizando un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético.

9. Un método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende:

expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos, conectar los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican, y aislar los complejos formados con ello.

10. Un método según la reivindicación 1, en el que, en la etapa (e) , los complejos se clasifican directamente basándose en sus propiedades ópticas cambiadas para aislar elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene la actividad deseada.

11. Un método según la reivindicación 1, en el que, en la etapa (e) , los complejos se hacen reaccionar posteriormente para inducir un cambio condicional en las propiedades ópticas del elemento genético que depende de la presencia de productos génicos con la actividad deseada en el complejo.

12. Un método según la reivindicación 1, en el que los complejos se someten a otra etapa de compartimentación para aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene la actividad deseada.

13. Un método según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un producto génico con propiedades ópticas distintivas al elemento genético.

14. Un método según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un ligando con propiedades ópticas distintivas al producto génico.

15. Un método según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del producto génico cuando está unido a un ligando.

16. Un método según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del ligando cuando es unido por el producto génico.

17. Un método según la reivindicación 16, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del ligando y del producto génico tras su unión.

18. Un método según la reivindicación 16, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a las diferentes propiedades ópticas del sustrato y del producto de la reacción que se está aislando.

19. Un método según la reivindicación 18, en el que el sustrato y el producto tienen propiedades ópticas similares, pero sólo el producto, y no el sustrato de la reacción que se está aislando, se une o reacciona con el elemento genético, cambiando con ello las propiedades ópticas del elemento genético.

20. Un método según la reivindicación 1, en el que otros reactivos se unen de modo específico, o reaccionan de modo específico con el producto (y no con el sustrato) unido al elemento genético, alterando con ello las propiedades ópticas del elemento genético.

21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una actividad no deseada de un producto génico da como resultado un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético que se diferencia del que aparece como resultado de la actividad deseada.

22. Un método según la reivindicación 21, en el que el cambio óptico que aparece como resultado de la actividad no deseada se emplea para seleccionar negativamente los elementos genéticos.

23. Un método según la reivindicación 21, en el que una selección negativa se combina con una selección positiva para mejorar la especificidad de la reacción.

24. Un método según la reivindicación 23, en el que la especificidad de reacción mejorada es una mejora en la especificidad de unión.

25. Un método según la reivindicación 24, en el que la especificidad de reacción mejorada es una mejora en la regio-y/o estereoselectividad por el sustrato y/o el producto.

26. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aislan a partir de un banco de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos.

27. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada elemento genético codifica dos o más genes, y cada producto génico debe tener una actividad deseada para que las propiedades ópticas del elemento genético puedan modificarse para permitir que sean clasificados.

28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada elemento genético codifica dos o más genes, y los productos génicos deben unirse entre sí en la microcápsula para que las propiedades ópticas del elemento genético puedan modificarse y los elementos genéticos puedan clasificarse.

29. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional de:

(e) introducir una o más mutaciones en el elemento o elementos genéticos clasificados en la etapa (d) .

30. Un método según la reivindicación 29, que comprende además repetir iterativamente una o más de las etapas

(a) a (e) .

31. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además amplificar los elementos genéticos.

32. Un método según la reivindicación 1, en el que la microencapsulación se logra formando una emulsión de agua en aceite de la disolución acuosa en un medio con una base de aceite.

33. Un método según la reivindicación 1, en el que el elemento genético comprende el producto génico unido a una microesfera.

34. Un método según la reivindicación 33, en el que la microesfera es no magnética, magnética o paramagnética.

35. Un método según la reivindicación 1, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante la detección de un cambio en su fluorescencia.

36. Un método según la reivindicación 35, en el que la clasificación de los elementos genéticos se realiza utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) .

37. Un método según la reivindicación 35, en el que las diferentes propiedades de fluorescencia de un sustrato y del producto son debidas a la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) .

38. Un método según las reivindicaciones anteriores, en el que el entorno interno de las microcápsulas se modifica mediante la adición de uno o más reactivos a una fase oleosa.

39. Un método según la reivindicación 1, en el que los elementos genéticos modificados directa o indirectamente por la actividad del producto génico deseado se modifican posterioremente mediante una amplificación de señal de tiramida, dando como resultado, directa o indirectamente, un cambio en las propiedades ópticas de dichos elementos genéticos permitiendo con ello su separación.