MÉTODO DE DETERMINACIÓN DEL ESTATUS VACUNAL DE PERSONAS.

Método de determinación del estatus vacunal de personas. La presente invención se refiere a un método y a un equipo de diagnóstico para la determinación serológica del estatus vacunal de personas. La vacunación consiste en introducir por una vía de administración apropiada uno o varios antígenos de un agente patógeno bacteriano, vírico o parasitario, eventualmente asociado a una o varias sustancias que estimula(n) la respuesta inmunitaria contra este(os) antígeno(s) (adyuvantes vacunales). Sea cual sea el modo de vacunación, el objetivo es la implantación en la persona vacunada de una respuesta inmunitaria específica del patógeno que comprende una inmunidad de memoria, es decir susceptible de responder en algunas horas a una nueva introducción del patógeno protegiendo así eficazmente a la persona contra el patógeno. Una modalidad particular y esencial de la inmunidad conferida por la vacunación es la producción de anticuerpos específicos del antígeno vacunal. La protección conferida por la vacunación no es permanente, y es adquirida sólo durante un lapso de tiempo comprendido entre algunos meses y algunos decenios. En efecto, el patógeno contra el cual se realiza la vacunación puede presentar unas modificaciones periódicas de su composición antigénica que hace parcial o completamente caduca la protección conferida por la vacunación con la composición antigénica anterior. Asimismo, la prevalencia relativa de diferentes variantes antigénicas (serotipos) del patógeno en función del tiempo y del país considerado, obliga a modificar la composición de la vacuna para incorporar en ella los antígenos de los serotipos nuevamente prevalentes. Esto se ilustra mediante las recomendaciones vacunales elaboradas específicamente para los viajeros que van a países de fuerte endemia de estos patógenos [Mackell SM. Vaccinations for the pédiatrie traveler. Clin. Infect. Dis. 2003, 37:1508-1515; Kirkpatrick B.D & Kemper Alston W. Current immunization for travel. Current Opinion in Infections Diseases 2003,16: 369-374]. Por otra parte, la duración de vida de los anticuerpos protectores inducidos por la vacuna está limitada a algunos años en ausencia de nueva estimulación antigénica por contacto con el patógeno, o por una nueva vacunación. Asimismo, la respuesta individual puede variar según el estado inmunitario en el momento de la vacunación y según la vía de administración. Estas tres razones, modificaciones antigénicas del patógeno, desaparición progresiva de los anticuerpos protectores específicos y heterogeneidad de respuesta, imponen una re-vacunación de las personas en forma de recuerdos vacunales. La vacunación y la administración de un recuerdo vacunal se pueden analizar teniendo en cuenta los efectos secundarios conocidos de ciertas vacunas, un análisis coste/beneficio, y la selección libre de la persona para las vacunas que no son obligatorias en el ámbito de las recomendaciones publicadas en forma de calendario vacunal que precisa las modalidades de administración de la vacuna y de los eventuales recuerdos de ésta [anónimo - Calendario vacunal 2003, Avis du Conseil Supérieur d'hygiène publique de France. Bulletin Epidémiologique hebdomadaire 2003, 6:33-36]. En efecto, la actitud del recuerdo vacunal sistemático de la población es cada vez más cuestionada debido a los análisis coste-beneficio y la presión de la opinión pública. Una decisión de recuerdo vacunal adaptado individualmente al estatus inmunitario de la persona es por lo tanto deseable. En efecto, el coste de la vacunación es una apuesta considerable no sólo para los países industrializados sino sobre todo para los países en desarrollo (PED) [Carabin H & Edmunds WJ. Future savings form measles eradication in industrialized countries. J. Infect. Dis. 2003,187 (supl. 1): 529-535]. La determinación en el suero de la persona a vacunar de la presencia, incluso del porcentaje de anticuerpos protectores específicos, debería ser un elemento clave para decidir la administración de la vacuna o del recuerdo vacunal. En efecto, si el suero de la persona contiene unos anticuerpos específicos del patógeno en una concentración protectora, no existe ningún beneficio, sino todo lo contrario, un riesgo de administrar un recuerdo vacunal a esta persona. La búsqueda de la presencia de anticuerpos de clase IgG específicos se realiza actualmente en los laboratorios para los virus del sarampión, de las paperas y de la rubéola. La determinación en laboratorio de la concentración de anticuerpos específicos se realiza sólo para el virus B de la hepatitis: un porcentaje de anticuerpos anti HBs > 10 mUl/ml se considera como protector contra la infección por el virus B de la hepatitis y no justifica un recuerdo vacunal. Para la detección de los anticuerpos antitetánicos (dirigida contra la toxina tetánica), se han desarrollado algunos ensayos rápidos basados en una técnica de hemaglutinación pasiva (Vacci-test ® Pasteur ® ) o en la inmunocromatografía para mejorar la atención de heridos. En los métodos propuestos actualmente, la detección de la presencia o la medición de la concentración de los anticuerpos dirigidos específicamente contra los diferentes antígenos vacunales se realizan separadamente entre sí. Por lo tanto, se necesita realizar varias extracciones de suero que se analizarán separadamente, llegado el caso, en varios laboratorios que disponen cada uno de una capacidad de análisis de un solo antígeno vacunal o de un número restringido de antígenos vacunales. Algunos estudios mencionan la determinación de una parte del estatus vacunal de la persona. Por ejemplo, un estudio de seroprevalencia contra los virus de las paperas, del sarampión, de la rubéola y de la varicela se ha realizado en personal sanitario en Japón en el ámbito de un programa vacunal contra estos patógenos [Asari S. et 2   al. Seroprevalence survey of measles, rubella, varicella and mumps antibodies in health care workers and évaluation of a vaccination program in a tertiary care hospital in Japan; Am. J. Infect. Control. 2003, 31:157-162]. En este trabajo, se ha realizado una única extracción de sangre, pero los cuatro ensayos serológicos, a pesar de ser realizados por el mismo laboratorio, fueron realizados utilizando placas de microtitulación diferentes sobre cada una de las cuales se fijaba un antígeno de un solo agente patógeno y según unos métodos diferentes. Los métodos ELISA utilizados no permitían determinar el título de los anticuerpos específicos ensayados. Los métodos ELISA utilizados implicaban, además, teniendo en cuenta la naturaleza del soporte sólido utilizado, la extracción y el análisis sobre muestras de volumen relativamente importante de suero, a saber un volumen necesario para llenar varios pocillos de microplacas. Este trabajo no ha permitido determinar una seroconversión contra los antígenos específicos después de una vacunación en 20% de las personas vacunadas contra el sarampión y contra la rubéola y en 50% de las personas vacunadas contra las paperas, imputable a una sensibilidad mediocre de los métodos de detección utilizados. Los diferentes métodos propuestos para la determinación del estatus vacunal implican frecuentemente unos plazos de respuesta para obtener los resultados superiores a 24 horas y, en general, con una sensibilidad y por lo tanto una fiabilidad mediocres. No existe actualmente ningún equipo, ningún ensayo automatizado y reproducible, que permita la determinación del estatus vacunal de una persona mediante la determinación del título de anticuerpos específicos contra los principales patógenos vacunales. Así, no se proporciona actualmente ningún método ni kit que permitan determinar en un plazo de tiempo inferior a 24 horas sobre una sola extracción de suero, el estatus vacunal de una persona, es decir la detección o la determinación de las concentraciones de anticuerpos de clase IgG específicos en relación con el conjunto de las vacunas actualmente disponibles. El objetivo de la presente invención es proporcionar una técnica de determinación del estatus vacunal de una persona que sea simple, rápido y poco costoso, que se pueda utilizar en particular por cualquier laboratorio para conocer simultáneamente mediante análisis de una misma muestra de suero a ensayar, la concentración de anticuerpos contra una pluralidad de vacunas actualmente disponibles, en un volumen de muestras relativamente reducido y por lo tanto compatible para unas extracciones en el niño, incluyendo el lactante. Más particularmente aún, la técnica de diagnóstico debe poder ser automatizable y reproducible de manera fiable, tanto en su utilización como en la preparación de los soportes sólidos utilizados. Con este fin, la presente invención proporciona un método de determinación serológica del estatus vacunal de un individuo... [Seguir leyendo]

1. Método de determinación serológica del estatus vacunal de un individuo mediante la detección y cuantificación de los anticuerpos séricos de tipo IgG específicos de antígenos vacunales de una pluralidad de agentes patógenos de tipo bacterias, virus, hongos o parásitos, caracterizado porque se lleva a cabo la detección y la cuantificación de un complejo de reacciones inmunológicas entre cada dicho antígeno vacunal y respectivamente cada dicho anticuerpo específico de tipo IgG de dicho antígeno vacunal, eventualmente presentes en una muestra de suero humano a ensayar, realizando las etapas siguientes: 1- poner en contacto una única y misma muestra de suero a ensayar con: - un mismo soporte sólido en el que se fija una pluralidad de dichos antígenos vacunales que corresponden a una pluralidad de agentes patógenos diferentes, preferentemente por lo menos 3, más preferentemente por lo menos 4 antígenos vacunales de agentes patógenos diferentes, en unas zonas diferentes del soporte, - en presencia de por lo menos una sustancia de detección que reacciona mediante complejación con dichos anticuerpos específicos de tipo IgG y que no reaccionan con dichos antígenos vacunales, y 2- determinar la concentración en dichos anticuerpos específicos de tipo IgG mediante la cuantificación de los complejos que resultan de la reacción de por lo menos una sustancia de detección con dichos anticuerpos específicos de tipo IgG complejados con dichos antígenos vacunales fijados sobre dicho soporte sólido. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha sustancia de detección comprende un marcado fluorescente. 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque se determina la concentración de dichas inmunoglobulinas de la especie del paciente de clase G específica de dicho antígeno vacunal en la muestra a ensayar, mediante la lectura automatizada de la intensidad de la señal fluorescente emitida por dicho elemento de marcado fluorescente con la ayuda de un aparato de lectura apropiado capaz de cuantificarla. 4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dichos antígenos vacunales comprenden por lo menos 3, preferentemente de 3 a 12 antígenos vacunales de agentes patógenos diferentes seleccionados de entre los virus de las paperas, de la rubéola, del sarampión, de la varicela, de la poliomielitis, de la fiebre amarilla, de la encefalitis por garrapata, de la hepatitis A, de la hepatitis B y las bacterias de la tos ferina Bordetella pertussis, del tétanos y de la difteria. 5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se determina si la concentración de dichos anticuerpos específicos de tipo IgG alcanza un umbral determinado a partir del cual dicho anticuerpo específico tiene una acción protectora que protege contra la enfermedad determinada por el patógeno. 6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza una única sustancia de detección para la detección de los diferentes anticuerpos específicos de los diferentes antígenos vacunales. 7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque se utiliza una sustancia de detección que es una inmunoglobulina anti-IgG, preferentemente una inmunoglobulina de cabra o de polluelo. 8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se controla la presencia y la reactividad de dicha primera sustancia de detección realizando las etapas siguientes: - poner en contacto dicha muestra a ensayar con un mismo soporte sólido, en el que se ha fijado además un primer antígeno de control que es una inmunoglobulina no específica de clase G, en presencia de una disolución que contiene una primera sustancia de detección, y - verificar si dicha sustancia de detección ha reaccionado con dicho primer antígeno de control fijado sobre dicho soporte sólido. 9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se controla la eventual presencia de un anticuerpo antinuclear en dicha muestra a ensayar, - poniendo en contacto dicha muestra a ensayar con * un mismo soporte sólido en el que se ha fijado un segundo antígeno de control que comprende unos complejos ADN/histonas, preferentemente que comprende unos núcleos de células nucleadas de células de la especie del paciente, más preferentemente la totalidad o parte de células de origen de la especie del paciente en línea continua, y 17   * en presencia de una sustancia de detección constituida por un anticuerpo de marcado que reacciona sólo con una inmunoglobulina de la especie del paciente de clase G; y - verificando si dicho segundo antígeno de control fijado en el soporte sólido reacciona con dicha sustancia de detección. 10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se controla que dicha muestra ensayada contenga un suero de la especie del paciente, detectando si unas inmunoglobulinas de la especie del paciente reaccionan con un tercer antígeno de control que contiene la proteína A de una bacteria Staphylococcus aureus, preferentemente poniendo en contacto dicha muestra con un mismo soporte sólido en el que se fija un tercer antígeno de control, en presencia de una misma sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina de la especie del paciente y no con dicho tercer antígeno de control, preferentemente un anticuerpo antiinmunoglobulina de la especie del paciente y que no reacciona con la proteína A. 11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho tercer antígeno de control es una bacteria Staphylococcus entera que comprende la proteína A. 12. Método según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque dicha sustancia de detección es una inmunoglobulina de cabra o de polluelo anti IgG, conjugada con una sustancia fluorescente. 13. Método según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque por lo menos un antígeno vacunal es un antígeno microbiano corpuscular constituido por un microbio entero desactivado o fracción de microbio, preferentemente fijado sobre el sólido mediante simple depósito y adsorción física o unión fisicoquímica con el soporte, preferentemente en mezcla con un ligante proteico. 14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque dichos antígenos corpusculares vacunales y/o de control están asociados a un colorante, preferentemente un colorante fluorescente. 15. Método según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque dicho ligante proteico se selecciona de entre la yema de huevo, la gelatina, la albúmina de suero bovino o una IgG policlonal no humana, preferentemente de cabra. 16. Método según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque dicho antígeno vacunal corpuscular está mezclado con una inmunoglobulina de IgG policlonal de cabra. 17. Método según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se utiliza como soporte sólido una lámina de vidrio o de plástico, o un pocillo de fondo plano de placa de microtitulación de vidrio o de plástico. 18. Método según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque se recoge un volumen determinado de sangre total con la ayuda de un tubo capilar en un frasco que contiene un volumen determinado de un tampón que permite la elución del suero, siendo el suero entonces diluido preferentemente a una concentración determinada, preferentemente de 1/100 a 1/20, y se deposita un volumen determinado de suero así diluido sobre diferentes zonas de depósito de dichos antígenos de control y antígenos vacunales sobre dicho soporte sólido. 19. Método según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque, para cada detección y, llegado el caso, cuantificación de un antígeno vacunal, se realizan las mediciones siguientes: 1- una primera medición de un primer valor representativo de la cantidad de un primer elemento de marcado preferentemente el primer valor de la intensidad de una señal emitida por dicho primer elemento de marcado fluorescente, fijándose dicho primer elemento de marcado de manera no específica sobre cualquier proteína en la zona de depósito de dicho antígeno vacunal, y 2- una segunda medición de un segundo valor representativo de la cantidad de un segundo elemento de marcado diferente de dicho primer elemento de marcado y que emite una señal diferente, preferentemente un segundo valor de la intensidad de la señal emitida por este segundo elemento de marcado fluorescente a una longitud de onda de excitación diferente de la de dicho primer elemento de marcado fluorescente, siendo dicho segundo elemento de marcado el elemento de marcado de dicha sustancia de detección de dicho antígeno vacunal, en la zona de depósito de dicho antígeno, y 3- se calcula la relación de dicho primer y segundo valores, y 4- se compara el valor de dicha relación con la de una relación de referencia obtenida con una colección de sueros de referencia positivos y negativos, permitiendo así mediante comparación determinar la necesidad o no de vacunar a la persona para dicho antígeno según el valor de la relación de dichos primer y segundo valores. 18   19