ANÁLISIS SECUENCIAL DE MUESTRAS BIOLÓGICAS CON BLANQUEO DE SEÑALES FLUORESCENTES INTERMEDIAS.

Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias Antecedentes En el presente documento se divulgan procedimientos para analizar secuencialmente una muestra biológidca para discernir características de la muestra, por ejemplo, la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en una muestra biológica. Se han usado varios procedimientos en biología y en medicina para observar dianas diferentes en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede realizar análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia. Muchas de las técnicas actuales pueden detectar únicamente unas pocas dianas a la vez (tal como, IHC cuando el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Análisis adicionales de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente, lo que limita la capacidad para determinar las características relativas de las dianas, tales como la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en ciertos casos, se dispone de una cantidad limitada de la muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir más análisis. Por tanto se necesitan procedimientos, agentes y dispositivos capaces de analizar repetidamente una muestra individual. Breve descripción En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos de detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los procedimientos incluyen las etapas de poner en contacto la muestra con una primera sonda, unir físicamente la primera sonda con una primera diana, observar una primera señal de la primera sonda, aplicar un agente químico que comprende una base, un nucleófilo o un agente oxidante para modificar la primera señal, poner en contacto la muestra con una segunda sonda, unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana y observar una segunda señal de la segunda sonda. El procedimiento de poner en contacto, unir, observar y modificar se puede repetir de forma iterativa. En algunas realizaciones se proporcionan kits para la detección de múltiples dianas en una muestra biológica. El kit incluye una primera sonda capaz de unirse a una primera diana y proporcionar una primera señal y una segunda diana capaz de unirse a una segunda diana y proporcionar una segunda señal. La primera sonda responde a un agente químico para dar como resultado la modificación de la primera señal. Los kit proporcionados en el presente documento pueden también incluir sondas adicionales (p. ej., segunda, tercera o enésima) capaces de unirse a una diana y proporcionar múltiples dianas. En algunas realizaciones se proporcionan dispositivos que incluyen un sistema de manipulación de muestras, un sistema de dispensación de reactivos y un sistema de detección de señal. El dispositivo se puede usar para detectar múltiples dianas en una muestra biológica usando el procedimiento que incluye las etapas de: poner en contacto la muestra con una primera sonda, unir físicamente la primera sonda con una primera diana, observar una primera señal de la primera sonda, aplicar un agente químico para modificar la primera señal, poner en contacto la muestra con una segunda sonda, unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana y observar una segunda señal de la segunda sonda. Breve descripción de las figuras La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras 10 minutos y 15 minutos. La FIG.2 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda. La FIG.3 es el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como función de la longitud de onda, tras 30 minutos y 140 minutos. La FIG.4 es el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 60 minutos y 210 minutos. La FIG.5 es el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos. La FIG. 6 es el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como función de la longitud de onda, tras 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos. 2 E07874282 10-11-2011   La FIG.7 es el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a como función de la longitud de onda. La FIG.8 es el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como función de la longitud de onda. La FIG.9 es el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como función de la longitud de onda. La FIG. 10 es el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como función de la longitud de onda. La FIG. 11 es el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como función de la longitud de onda. La FIG. 12 representa las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 18a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 18b (tras la modificación de la señal). La FIG. 13 representa las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 19a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 19b (tras la modificación de la señal). La FIG. 14 representa las micrografías de la muestra 20a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 20b (tras la modificación de la señal). La FIG. 15 representa las micrografías de las muestras 21a y 21b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21c (tras la modificación de la señal). La FIG. 16 representa las micrografías de las muestras 22a y b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 22c (tras la modificación de la señal). La FIG. 17 representa las micrografías de las Muestras 23a-e. La FIG. 18 representa las micrografías de la muestra 24a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 24b (tras la modificación de la señal). La FIG. 19 representa las micrografías de las muestras 25a (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25b (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25c-25j. La FIG. 20 representa las micrografías de las Muestras 26a-h. La FIG. 21 representa las micrografías de las Muestras 27a-c. La FIG. 22 es un gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las imágenes del Ejemplo 20. La FIG. 23 muestra la comparación entre las micrografías de las Muestras 28a-c y 29a-c. La FIG. 24 representa las micrografías de las Muestras 30a-d. La FIG. 25 representa las micrografías de las Muestras 30c-f. La FIG. 26 es un gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las Muestras 30c y 30d. La FIG. 27 representa las micrografías de las Muestras 31a, 31b y 31c. La FIG. 28 representa las micrografías de las Muestras 32a, 32b y 32c. Descripción detallada Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se proporcionan las definiciones siguientes para términos específicos que se usan en la descripción siguiente y en las reivindicaciones adjuntas. Las formas del singular un, uno y el/la incluyen las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión aproximadamente, como se usa en el presente documento a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se puede aplicar para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variarse permisivamente sin que de cómo resultado un cambio en la función básica a la que se refiere. En consecuencia con esto, un valor modificado por un término tal como aproximadamente no se tiene que limitar al valor preciso especificado. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como el peso molecular, las condiciones de reacción, usadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término aproximadamente. De acuerdo con esto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva siguiente y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar en función de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debería interpretarse, al menos, a la luz del número de dígitos significativos 3 E07874282 10-11-2011   indicados y aplicando técnicas de redondeo habituales. Como se usa en el presente documento, la expresión muestra biológica se refiere a una muestra obtenida de un sujeto biológico, incluida una muestra de tejido o fluido biológico obtenido in vivo o in vitro. Dichas muestras pueden ser, entre otros, fluido corporal (p. ej., sangre, plasma sanguíneo, suero u orina), órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de mamíferos, incluidos seres humanos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de la muestra... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detectar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una primera sonda; (b) unir físicamente la primera sonda con una primera diana; (c) observar una primera señal de la primera sonda; (d) aplicar un agente químico que comprende una base, un nucleófilo o un agente oxidante para modificar la primera señal; (e) poner en contacto la muestra con una segunda sonda; (f) unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana; y (g) observar una segunda señal de la segunda sonda; 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la diana se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un polisacárido, un lípido, una enzima, un sustrato enzimático, un ligando, un receptor o un antígeno, un hapteno. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda comprende un aglutinante y un generador de señal. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el generador de está asociado con el aglutinante. 5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el aglutinante se selecciona un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un polisacárido, un lípido, una enzima, un sustrato enzimático, un inhibidor enzimático, un ligando, un receptor, un antígeno o un hapteno. 6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el generador de señal se selecciona de un cromóforo, un fluoróforo, una marca activa de Raman, un marcador radioactivo, una enzima o un sustrato enzimático. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación de la señal comprende una disminución de la intensidad de la señal, una desviación del pico de la señal, un cambio de la frecuencia resonante o la escisión del generador de señal. 8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende observar la señal tras la etapa de modificación de señal. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que una o ambas etapas de contacto comprende poner en contacto la muestra con una pluralidad de sondas, cada una con un aglutinante diferente y un generador de señal diferente. 10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende repetir las etapas (d) a (g) al menos una vez usando una o más sondas en la etapa (e). 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la sonda comprende un anticuerpo y un fluoróforo. 12. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende correlacionar el valor de la intensidad con una cantidad de la diana en la muestra biológica. 28 E07874282 10-11-2011   29 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   31 E07874282 10-11-2011   32 E07874282 10-11-2011   33 E07874282 10-11-2011   34 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   36 E07874282 10-11-2011   37 E07874282 10-11-2011   38 E07874282 10-11-2011   39 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   41 E07874282 10-11-2011   42 E07874282 10-11-2011   43 E07874282 10-11-2011   44 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   46 E07874282 10-11-2011   47 E07874282 10-11-2011   48 E07874282 10-11-2011   49 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   51 E07874282 10-11-2011   52 E07874282 10-11-2011   53 E07874282 10-11-2011   54 E07874282 10-11-2011   E07874282 10-11-2011   56 E07874282 10-11-2011