ANÁLISIS SECUENCIAL DE MUESTRAS BIOLÓGICAS.

En el presente documento se divulgan procedimientos para analizar secuencialmente una muestra biológica para discernir, entre otros, la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en una muestra biológica. Se han usado varios procedimientos en biología y en medicina para observar dianas diferentes en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede realizar análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia. El análisis de proteínas en muestras biológicas también se puede realizar usando inmunoensayos en estado sólido usando, por ejemplo, las técnicas de transferencias de tipo western. Muchas de las técnicas actuales pueden detectar únicamente unas pocas dianas a la vez (tal como, IGC o transferencias de tipo western basadas en fluorescencia, en las que el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Análisis adicionales de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente, lo que limita la capacidad para determinar las características relativas de las dianas, tales como la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en ciertos casos, se dispone de una cantidad limitada de la muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir más análisis. Por tanto se necesitan procedimientos, agentes y dispositivos capaces de analizar repetidamente una muestra individual. Breve descripción En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos de detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra biológica que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra y unir al menos una sonda control a una o más dianas presentes en la muestra. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente de la sonda fluorescente y una señal control de la sonda control, y aplicar a la muestra una solución básica que contiene un agente oxidante que inactiva de forma selectiva la sonda fluorescente y no la sonda control. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra y observar una señal de la sonda fluorescente. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra biológica que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra y unir al menos una sonda control a una o más dianas presentes en la muestra. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente de la sonda fluorescente y una señal control de la sonda control, y aplicar a la muestra una solución básica que contiene un agente oxidante que inactiva de forma selectiva la sonda fluorescente y no la sonda control. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra y observar una señal de la sonda fluorescente y localizar al menos dos dianas en la muestra. En algunas realizaciones se proporcionan kit para la detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los kits incluyen una sonda control y múltiples sondas fluorescentes que tienen un aglutinante acoplado a un generador de señal fluorescente. Cuando se aplica a la muestra, un agente oxidante inactiva sustancialmente la sonda fluorescente y no la sonda control. Descripción de las figuras La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras 10 minutos y 15 minutos. La FIG.2 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda. La FIG.3 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como función de la longitud de onda, tras 30 minutos y 140 minutos. La FIG.4 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 60 minutos y 210 minutos. La FIG.5 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos. La FIG.6 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como función de la longitud de onda, tras 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos. 2   La FIG.7 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a como función de la longitud de onda. La FIG.8 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como función de la longitud de onda. La FIG.9 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como función de la longitud de onda. La FIG. 10 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como función de la longitud de onda. La FIG. 11 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como función de la longitud de onda. La FIG. 12 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 18A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 18B (tras la modificación de la señal). La FIG. 13 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 19A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 19B (tras la modificación de la señal). FIG. La FIG. 14 muestra las micrografías de la muestra 20A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 20B (tras la modificación de la señal). La FIG. 15 muestra las micrografías de las muestras 21A y 21B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21C (tras la modificación de la señal). La FIG. 16 muestra las micrografías de las muestras 22A y 22B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 22C (tras la modificación de la señal). La FIG. 17 muestra las micrografías de las Muestras 23A-E. La FIG. 18 muestra las micrografías de la muestra 24A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 24b (tras la modificación de la señal). La FIG. 19 muestra las micrografías de las muestras 25A y 25A (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25B (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25C-25J. La FIG. 20 muestra las micrografías de las Muestras 26A-H. La FIG. 21 muestra las micrografías de las Muestras 27A-C. La FIG. 22 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las imágenes del Ejemplo 20. La FIG. 23 muestra la comparación entre las micrografías de las Muestras 28A-C y 29A-C. La FIG. 24 muestra las micrografías de las Muestras 30A-D. La FIG. 25 muestra las micrografías de las Muestras 30C-F. La FIG. 26 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las Muestras 30C y 30D. La FIG. 27 muestra las micrografías de las Muestras 31A, 31B y 31C. La FIG. 28 muestra las micrografías de las Muestras 32A, 32B y 32C. La FIG. 29 muestra las micrografías de las Muestras 33, 34, 35 y 36. La FIG. 30 muestra las transferencias puntuales de las Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 31 muestra el gráfico de barras de las intensidades de señal relativas de las transferencias para las Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 32 muestra el perfil de tiempo de los espectros Cy3 y Cy5. La FIG. 33 muestra los valores de absorbancia de Cy3 como una para diferentes concentraciones de H2O2. La FIG. 34 muestra los valores de absorbancia como función del tiempo para diferentes fluoróforos. La FIG. 35 muestra los valores de absorbancia de QD 655 como función del tiempo para H2O2. La FIG. 36 muestra los espectros de absorbancia para fluoresceína usando H2O2. Descripción detallada Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se 3   proporcionan las definiciones siguientes para términos específicos que se usan en la descripción siguiente y en las reivindicaciones adjuntas. Las formas del singular un, uno y el/la incluyen las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión aproximadamente, como se usa en el presente documento a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se puede aplicar para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variarse permisivamente sin que de cómo resultado un cambio en la función básica a la que se refiere. En consecuencia con esto, un valor modificado por un término tal como aproximadamente no se tiene que limitar al valor preciso especificado. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como el peso molecular, las condiciones de reacción, usadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término aproximadamente. De acuerdo con esto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de sondar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica que contiene múltiples dianas (b) unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra; (c) unir al menos una sonda control a una o más dianas presentes en la muestra; (d) observar una señal procedente de la sonda fluorescente unida en la etapa (b) y una señal control procedente de la sonda control unida en la etapa (c); (e) Aplicar a la muestra de la etapa (d) una solución que comprende un agente oxidante que inactiva de forma selectiva la sonda fluorescente y no la sonda control; (f) unir al menos una sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa (e); y (g) observar una señal procedente de la sonda fluorescente unida en la etapa (f). 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución de la etapa (d) es una solución básica. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de oxidación se realiza sin inactivar más de aproximadamente el 20 % de la sonda control. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente oxidante se selecciona de peróxido de hidrógeno, permanganato potásico, dicromato sódico, bromo acuoso, yoduro de yodo-potasio e hidroperóxido de t-butilo. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda fluorescente comprende un aglutinante y un generador de señal fluorescente. 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente comprende un pigmento de cianina. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda control comprende un radioisótopo. 8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las etapas (e)-(g) se repiten una o más veces. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (b) es el mismo que el generador de señal fluorescente en la etapa (e). 10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (b) es diferente del generador de señal fluorescente en la etapa (e). 36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49     51   52   53   54     56   57   58   59     61   62   63   64     66   67   68   69     71   72