PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR LA EMISIÓN DE LUZ A PARTIR DE UNA REACCIÓN QUIMIOLUMINISCENTE.

Procedimiento para aumentar la emisión de luz a partir de una reacción quimioluminiscente Campo de la invención La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para aumentar la emisión de luz generada por la reacción quimioluminiscente del luminol, una enzima peroxidasa, un oxidante y un mediador de electrones. Técnica antecedente La reacción quimioluminiscente es entre el luminol, una fuente de peróxido y una enzima peroxidasa, especialmente peroxidasa de rábano rusticano (HRP), que cataliza la oxidación del luminol por el peróxido. Dicha oxidación está acompañada por la emisión de luz. La oxidación quimioluminiscente del luminol catalizada por la peroxidasa encuentra un amplio empleo en ensayos analíticos de antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos, y en particular en ensayos de transferencia, por ejemplo, Dot Blots, transferencias de Western (proteínas), transferencias de Southern y Northern (ácidos nucleicos). Se sabe que la oxidación quimioluminiscente del luminol catalizada por la peroxidasa puede hacerse más rápida y más eficaz añadiendo un mediador, o potenciador de electrones, como se muestra, por ejemplo, por L.J. Kricka en Clinical Chemistry 1991; 37:1472-1481; o por L.J. Kricka, J.C. Voyta e I. Bronstein en "Chemiluminescent Methods for Detecting and Quantitating Enzyme Activity", Methods Enzymol. 2000; 305:370-390. Se han usado varios compuestos como mediadores de electrones. En particular, la luciferina de luciérnaga, el 6-hidroxibenzotriazol, el pyodofenol, el ácido p-cumárico se describen por G.H.G. Thorpe y L.J. Kricka, Methods Enzymol. 1986; 133:331; las aminas aromáticas en la patente de estados Unidos Nº 4279950; las acetanilidas en la solicitud de patente europea Nº 603953 (1994); los indofenoles y las fenotiazinas N-sustituidas y los indofenoles en la patente de Estados Unidos Nº 5171668; los ácidos borónico remplazados en la patente de Estados Unidos Nº 5629168. Se cree que en presencia de un mediador de electrones, la oxidación del luminol catalizada por la peroxidasa procede del siguiente modo: HRP + H2O2 HRP-I (1) HRP-I + LH - HRP-II + L ·- (2) HRP-II + LH - HRP + L ·- (3) HRP-I + E HRP-II + E - (4) HRP-II + E HRP-II + E - (5) E - + LH - E + L ·- (6) L ·- L + LH - (7) L + H2O2 LO2 2- (8) LO2 2- (AP 2- )* + N2 (9) (AP 2- )* AP 2- + h (10) donde HRP, HRP-I y HRP-II indican la enzima peroxidasa en la forma nativa y en sus dos formas oxidadas, respectivamente; LH - , LH ·- , L, LO2 2- representan el anión luminol, el anión del radical luminol, diazaquinona y el peróxido de luminol; E y E - representan el mediador de electrones y su radical correspondiente; finalmente, AP 2- indica el dianión del ácido 3-aminoftálico, y (AP 2- )* su estado excitado. De acuerdo con este esquema, la peroxidasa HRP se oxida por el peróxido en HRP-I. El anión luminol y el potenciador se oxidan por HRP-I en sus radicales respectivos con la conversión de la enzima en su forma HRP-II. A su vez, HRP-II oxida otra molécula de anión luminol o del mediador de electrones en sus respectivos radicales, regenerando simultáneamente la forma nativa de la enzima HRP, que puede participar en otro ciclo de oxidación. Por tanto se cree que el aumento en la señal quimioluminiscente se debe a la generación más rápida del intermedio clave LH ·- en presencia de un mediador de electrones (véase, por ejemplo, S.B. Vlasenko, A.A. Arefyev, A.D. Klimov, B.B. Kim, E.L. Gorovits, A.P. Osipov, E.M. Gavrilova, A.M. Yegorov, J. Biolumin. Chemilumin. 1989; 4:164-176, o B. Cercek, K. Roby, L. Cercek, J. Biolumin. Chemilumin. 1994; 9:273-277). Las fases posteriores de la reacción quimioluminiscente están menos claras. El anión del radical de luminol LH ·- es inestable y puede dismutar en el anión luminol LH y diazaquinona, L. La diazaquinona a su vez es probable que sea susceptible al ataque nucleófilo por el ión peróxido HO2 - en el carbono carbonílico (C=O), con la formación del peróxido de luminol LO2 2- , en la forma abierta o cíclica (endoperóxido). Finalmente, el peróxido de luminol se descompone en 3-aminoftalato, AP 2- , con la expulsión de nitrógeno molecular. Algo de la energía producida de este 2   modo se captura por el aminoftalato con la formación de su estado excitado (AP 2- )* y la posterior emisión de luz azul (425 nm). La eficacia de este proceso corresponde al rendimiento cuántico de fluorescencia del 3-aminoftalato (aproximadamente el 30%). Aunque no se conocen los detalles exactos de las reacciones (7)-(9), es concebible que la conversión del anión del radical de luminol, LH ·- , en peróxido de luminol, LO2 2- , implique el ataque nucleófilo del ión peróxido en un carbono carbonílico (C=O) del luminol (véase, por ejemplo, G. Merenyi, J. Lind y T.E. Eriksen "Nucleophilic Addition to Diazaquinones. Formation and Breakdown of Tetrahedral Intermediates in relation to Luminol Chemiluminescence", J. Am. Chem. Soc. 1986; 108:7716-7726). Por otra parte, la eficacia de esta reacción es decisiva para la formación de (Ap 2- )*. Objeto y sumario de la invención El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento para aumentar la emisión de luz generada por la reacción quimioluminiscente del luminol, una enzima peroxidasa, un oxidante y un mediador de electrones. De acuerdo con la invención, el objeto anterior se consigue gracias a la solución recordada específicamente en las consiguientes reivindicaciones, que se entiende que forma parte integral de la presente descripción. En una realización, esta invención proporciona el uso, en composiciones quimioluminiscentes, de un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) que pertenece a la clase de 4-aminopiridinas y particularmente compuestos definidos por la siguiente fórmula (I): en la que: R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)4- formando de este modo un anillo pirrolidona con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)5- formando de este modo un anillo piperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2- formando de este modo un anillo 4-metilpiperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)2-O-(CH2)2- formando de este modo un anillo morfolina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CHCH3)-CH=CH(CHCH3)- formando de este modo un anillo 2,5-dimetil-2,5-dihidro-1Hpirrol con el átomo de nitrógeno. En una realización, esta invención proporciona el uso, en composiciones quimioluminiscentes, de un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) que pertenece a la clase de 4-aminopiridinas y particularmente compuestos definidos por la siguiente fórmula (II): 3 en la que: X representa hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo o isopropilo, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o   X representa NH2, o N(metilo)2, o N(etilo)2, o N(propilo)2, o N(isopropilo)2, o N(butilo)2, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, o butilo. Aunque la presente invención se refiere al uso, en general y para cualquier propósito, de un catalizador de acilación hipernucleófila para aumentar la emisión de luz producida por la reacción quimioluminiscente, es principalmente aplicable, sin embargo, en el contexto de un ensayo. El término "ensayo" significa la detección, semicuantificación y cuantificación de un analito. Típicamente, la implementación de un ensayo requiere relacionar la producción de luz con la cantidad de peroxidasa usada, de modo que la peroxidasa es la sustancia determinada directamente. Aunque la presente invención es útil para determinar la presencia o cantidad de cualquiera de los compañeros de reacción (luminol; peroxidasa; oxidante; mediador de electrones; catalizador de acilación hipernucleófila), el compañero de reacción no es necesariamente la propia sustancia a determinar. Por ejemplo, el oxidante puede producirse por una reacción previa, o una serie de reacciones previas. La peroxidasa o el luminol pueden estar presentes en forma de un anticuerpo conjugado usado en un ensayo inmunoenzimático para determinar un antígeno. O la peroxidasa o el luminol pueden conjugarse con un nucleótido, un oligonucleótido o un ácido nucleico en ensayos de hibridación. Por lo tanto, la presente invención es aplicable a cualquier procedimiento de ensayo de diagnóstico de una sustancia cuya presencia o cantidad esté relacionada con la presencia o cantidad de un compañero de reacción seleccionado entre el grupo que consiste en luminol, una enzima peroxidasa, un oxidante, un potenciador y un catalizador de acilación hipernucleófila que correaccione en una reacción quimioluminiscente,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aumentar la emisión de luz producida por la reacción quimioluminiscente del luminol, una enzima peroxidasa, un oxidante y un mediador de electrones, caracterizado porque dicha reacción quimioluminiscente sucede en presencia de un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC). 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) se selecciona entre el grupo de compuestos representados por la Fórmula (I): en la que: R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o   R1 y R2 juntos representan -(CH2)4- formando de este modo un anillo pirrolidona con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)5- formando de este modo un anillo piperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2- formando de este modo un anillo 4-metilpiperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)-2-O-(CH2)2- formando de este modo un anillo morfolina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CHCH3)-CH=CH(CHCH3)- formando de este modo un anillo 2,5-dimetil-2,5-dihidro-1Hpirrol con el átomo de nitrógeno. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) se selecciona entre el grupo de compuestos representados por la Fórmula (II): en la que: X representa hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo o isopropilo, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o X representa NH2, o N(metilo)2, o N(etilo)2, o N(propilo)2, o N(isopropilo)2, o N(butilo)2, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, o butilo.   4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) se selecciona entre 4-dietilaminopiridina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina (PPY), 4-piperidinopiridina, 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), 4-morfolinopiridina (MORP), 4-(2,5-dimetil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)piridina, N,N-dimetil-N'-piridin-4-ilimidoformamida y N,N,N',N'tetrametil-N''-piridin-4-il-guanidina. 5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha enzima peroxidasa está libre o conjugada con un ligando. 6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha enzima peroxidasa es peroxidasa de rábano rusticano. 7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho oxidante es perborato sódico. 8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho mediador de electrones es p-yodofenol. 9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicho mediador de electrones es 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato sódico. 10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha reacción quimioluminiscente se realiza a un pH entre 8,0 y 10. 11. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico para la detección de un analito en una muestra, caracterizado porque dicho procedimiento comprende: a. la reacción de dicha muestra con un reactivo específico para dicho analito, en la que dicho reactivo específico está marcado con luminol o peroxidasa, con la formación de un complejo analito-reactivo marcado; b. la reacción de dicho complejo analito-reactivo marcado con una solución que comprende un oxidante, un mediador de electrones, un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) y i) luminol, si el reactivo específico para dicho analito está marcado con peroxidasa, o ii) peroxidasa, si el reactivo específico para dicho analito está marcado con luminol, que correaccionan en una reacción quimioluminiscente con emisión de luz y c. la detección de dicho analito mediante la medición de dicha emisión de luz. 12. Un procedimiento para realizar una ensayo de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho procedimiento comprende: a. la reacción de dicha muestra con un reactivo de captura específico para dicho analito con la formación de un complejo analito-reactivo de captura; b. la reacción de dicho complejo analito-reactivo de captura con dicho reactivo específico para dicho analito marcado con luminol o peroxidasa con la formación de un complejo reactivo marcado-analito-reactivo de captura; c. la reacción de dicho complejo reactivo marcado-analito-reactivo de captura con una solución que comprende un oxidante, un mediador de electrones, un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) y i) luminol, si dicho reactivo específico para dicho analito está marcado con peroxidasa, o ii) peroxidasa, si dicho reactivo específico para dicho analito está marcado con luminol, que correaccionan en una reacción quimioluminiscente con emisión de luz, y d. la detección de dicho analito mediante la medición de dicha emisión de luz. 13. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho procedimiento comprende: a. la reacción de dicha muestra con dicho reactivo específico para dicho analito marcado con luminol o peroxidasa con la formación de un complejo analito-reactivo marcado; b. la reacción de dicho complejo analito-reactivo marcado con un reactivo de captura específico para dicho analito con la formación de un complejo reactivo marcado-analito-reactivo de captura; c. la reacción de dicho complejo reactivo marcado-analito-reactivo de captura con una solución que comprende un oxidante, un mediador de electrones, un catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) y i) luminol, si dicho reactivo específico para dicho analito está marcado con peroxidasa, o ii) peroxidasa, si dicho reactivo específico para dicho analito está marcado con luminol, que correaccionan en una reacción quimioluminiscente con emisión de luz, y d. la detección de dicho analito mediante la medición de dicha emisión de luz. 11   14. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque dicho reactivo de captura está fijado en una fase sólida. 15. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque dicho reactivo de captura se selecciona entre un antígeno, un anticuerpo, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico monocatenario, un ácido nucleico bicatenario. 16. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque dicho reactivo marcado se selecciona entre un antígeno, un anticuerpo, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico monocatenario, un ácido nucleico bicatenario. 17. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque dicho catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) es un compuesto seleccionado entre el grupo de compuestos representados por la Fórmula (I): en la que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)4- formando de este modo un anillo pirrolidona con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)5- formando de este modo un anillo piperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2- formando de este modo un anillo 4-metilpiperidina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CH2)2-O-(CH2)2- formando de este modo un anillo morfolina con el átomo de nitrógeno, o R1 y R2 juntos representan -(CHCH3)-CH=CH(CHCH3)-formando de este modo un anillo 2,5-dimetil-2,5-dihidro-1Hpirrol con el átomo de nitrógeno. 18. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque dicho catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) es un compuesto seleccionado entre el grupo de compuestos representados por la Fórmula (II): en la que: X representa hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo o isopropilo, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, butilo e isopropilo, o 12   X representa NH2, o N(metilo)2, o N(etilo)2, o N(propilo)2, o N(isopropilo)2, o N(butilo)2, mientras que R1 y R2 representan ambos o cada uno por separado, hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, o butilo. 19. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque el oxidante es perborato sódico. 20. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, caracterizado porque el mediador de electrones es 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato sódico o pyodofenol. 21. Un procedimiento para realizar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, caracterizado porque el catalizador de acilación hipernucleófila (HNAC) se selecciona entre 4- dietilaminopiridina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina (PPY), 4-piperidinopiridina, 4-(4-metilpiperidin- 1-il)piridina (MPP), 4-morfolinopiridina (MORP), 4-(2,5-dimetil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)piridina, N,N-dimetil-N'-piridin- 4-ilimido-formamida y N,N,N',N'-tetrametil-N''-piridin-4-il-guanidina. 22. Kit para realizar un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, comprendiendo el kit luminol, un oxidante, un mediador de electrones y un catalizador de acilación hipernucleófila como se define en las reivindicaciones 2 y 3. 13   14     16   17