ENDONUCLEASAS FEN-1, MEZCLAS Y PROCEDIMIENTOS DE ESCISIÓN.

Una endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada de una especie arquebacteriana.

Endonucleasas FEN-1, mezclas y procedimientos de escisión Campo de la invención La presente invención se refiere a medios para la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en secuencias de ácido nucleico. La presente invención se refiere a procedimientos para formar una estructura de escisión de ácido nucleico en una secuencia diana y escindir la estructura de escisión de ácido nucleico de un modo específico de sitio. Se usa la actividad nucleasa 5' de una diversidad de enzimas para escindir la estructura de escisión dependiente de diana, indicando de este modo la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico o variaciones específicas de las mismas. La presente invención proporciona además procedimientos y dispositivos novedosos para la separación de moléculas de ácido nucleico basándose en la carga.

Antecedentes de la invención La detección y caracterización de secuencias específicas de ácido nucleico y variaciones de secuencia se han utilizado para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico víricas o bacterianas indicativas de una infección, la presencia de variantes o alelos de genes de mamífero asociados a enfermedad y cánceres y la identificación de la fuente de ácidos nucleicos encontrada en muestras forenses, así como en determinaciones de paternidad.

En la técnica se conocen diversos procedimientos que se pueden usar para detectar y caracterizar secuencias específicas de ácido nucleico y variantes de secuencia. Sin embargo, ya que los datos de secuencia de ácido nucleico del genoma humano así como los genomas de organismos patógenos se acumulan, continúa creciendo la demanda de ensayos rápidos, fiables, económicos y cómodos para el usuario para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas. Lo que es aún más importante, estos ensayos tienen que ser capaces de crear una señal detectable a partir de muestras que contienen muy pocas copias de la secuencia de interés. La siguiente discusión examina dos niveles de ensayos de detección de ácido nucleico que se usan actualmente: I. Tecnología de Amplificación de Señal para detección de secuencias raras; y II. Tecnología de Detección Directa para la detección de secuencias con un mayor número de copias.

I. Procedimientos de Tecnología de Amplificación de Señal para Amplificación La “Reacción en Cadena de la Polimerasa” (PCR) comprende la primera generación de procedimientos para la amplificación de ácido nucleico. Sin embargo, se han desarrollado varios procedimientos diferentes que emplean la misma base de especificidad, pero que crean señal mediante diferentes mecanismos de amplificación. Estos procedimientos incluyen la “Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR) ”, “Reacción Sintética Auto-Mantenida” (3SR/NASBA) y “Replicasa Qº” (Qº) .

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202 de Mullis y Mullis y col., (cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia) describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Esta tecnología proporciona una estrategia para los problemas de una baja concentración de secuencia diana. Se puede usar PCR para aumentar directamente la concentración de la diana hasta un nivel fácilmente detectable. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de los dos cebadores oligonucleotídicos que son complementarios con sus cadenas respectivas de la secuencia diana de doble hélice a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada. La mezcla se desnaturaliza y después se deja hibridar. Después de la hibridación, los cebadores se extienden con polimerasa para formar cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión por polimerasa se pueden repetir tan a menudo como sea necesario, para obtener concentraciones relativamente altas de un segmento de la secuencia diana deseada.

La longitud del segmento de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido a que los segmentos deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que se “amplifican por PCR”.

Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR o LAR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR; denominada en ocasiones “Reacción de Amplificación de la Ligasa” (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 189 (1991) ; Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5 (1991) ; y Wu y Wallace, Genomics 4: 560 (1989) se ha desarrollado hasta un procedimiento alternativo bien reconocido para amplificar ácidos nucleicos. En la LCR se mezclan cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que hibridan de forma única con una cadena de ADN diana y un conjunto complementario de oligonucleótidos adyacentes, que hibridan con la cadena opuesta y se añade ADN ligasa a la mezcla. Con la condición de que haya una complementariedad completa en la unión, la ligasa ligará covalentemente cada conjunto de moléculas hibridadas. Lo que es aún mas importante, en la LCR se ligan dos sondas entre sí solamente cuando tienen emparejamiento de bases con secuencias en la muestra diana, sin huecos o apareamientos erróneos. Ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y ligación amplifican un segmento corto de ADN. La LCR también se ha usado en combinación con PCR para conseguir detección mejorada de cambios de una única base. Segev, PCT Public. Nº W09001069 A1 (1990) . Sin embargo, debido a que los cuatro oligonucleótidos usados en este ensayo se pueden emparejar para formar dos cortos fragmentos que se pueden ligar, existe el potencial de la generación de señal de fondo independiente de diana. El uso de LCR para selección de mutante está limitado al examen de posiciones de ácido nucleico específicas.

Reacción Sintética Auto-Mantenida (3SR/NASBA)

La reacción de replicación de secuencia auto-mantenida (3SR) (Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 1874-1878, [1990], con una errata en Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 7797 [1990]) es un sistema de amplificación in vitro basado en transcripción (Kwok y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1173-1177 [1989]) que puede amplificar exponencialmente secuencias de ARN a una temperatura uniforme. Después, el ARN amplificado se puede utilizar para detección de mutación (Fahy y col. PCR Meth. Appl., 1: 25-33, [1991]) . En este procedimiento se usa un cebador oligonucleotídico para añadir un promotor de ARN polimerasa de fago al extremo 5' de la secuencia de interés. En una combinación de enzimas y sustratos que incluye un segundo cebador, transcriptasa inversa, RNasa H, ARN polimerasa y ribo- y desoxirribonucleósidos trifosfato, la secuencia diana experimenta rondas repetidas de transcripción, síntesis de ADNc y síntesis de segunda cadena para amplificar el área de interés. El uso de 3SR para detectar mutaciones está limitado cinéticamente a la exploración de pequeños segmentos de ADN (por ejemplo, 200-300 pares de bases) .

Replicasa Q-Beta (QI)

En este procedimiento, una sonda que reconoce la secuencia de interés se une al molde de ARN replicable para replicasa Q . Un problema principal que se ha identificado previamente con falsos positivos que se producen por la replicación de sondas no hibridadas se ha abordado mediante el uso de una etapa de ligación específica de secuencia. Sin embargo, las ADN ligasas termoestables disponibles no son eficaces sobre este sustrato de ARN, de tal forma que se tiene que realizar la ligación mediante ADN ligasa de T4 a temperaturas bajas (37º C) . Esto evita el uso de temperatura alta como un medio para conseguir especificidad como en la LCR, el acontecimiento de ligación se puede usar para detectar una mutación en el sitio de unión, pero no en otro lugar.

La siguiente tabla 1 enumera algunas de las características deseables para sistemas útiles en diagnósticos de ácido nucleico sensibles y resume las capacidades de cada uno de los principales procedimientos de amplificación (Véase también Landgren, Trends in Genetics 9: 199 [1993]) .

Un procedimiento de diagnóstico exitoso tiene que ser muy específico. Un procedimiento directo para controlar la especificidad de hibridación... [Seguir leyendo]

1. Una endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada de una especie arquebacteriana.

2. Un vector de ADN recombinante que comprende un oligonucleótido aislado que codifica una endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termostable de una especie arquebacteriana.

3. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la reivindicación 2.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 3, en la que dicha célula hospedadora es una célula de Escherichia coli.

5. Un procedimiento para tratar ácido nucleico, que comprende:

a) proporcionar: i) una endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada de una especie arquebacteriana; y ii) una estructura de escisión de ácido nucleico;

b) hacer reaccionar dicha endonucleasa con dichas estructuras de escisión de ácido nucleico de tal forma que se escinde dicha estructura de escisión de ácido nucleico.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha estructura de escisión de ácido nucleico comprende un dúplex formado entre una sonda oligonucleotídica y un ácido nucleico diana.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada se seleciona del grupo que consiste en endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus, endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, que además comprende la etapa c) de detectar la escisión de dicha estructura de escisión.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha detección comprende la detección de fluorescencia.

10. Un kit de tratamiento de ácido nucleico, que comprende: a) una composición que comprende una endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada de una

especie arquebacteriana; y b) una solución tampón.

11. El kit de la reivindicación 10, que además comprende una sonda oligonucleótida.

12. El kit de la reivindicación 11, que además comprende uno o más ácidos nucleicos diana.

13. El kit de la reivindicación 10, en el que dicha endonucleasa Flap 1 (FEN-1) termoestable purificada se seleciona del grupo que consiste en endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus, endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum y endonucleasas FEN-1 quiméricas.

FIGURA 78